Phân tích Pyrrolizidine alkaloids trong thảo mộc

1. Giới thiệu Alkaloid pyrrolizidine

Alkaloid pyrrolizidine (PAs) là một nhóm lớn các chất chuyển hóa thứ cấp tự nhiên với cấu trúc alkaloid được cây sản xuất nhằm tự vệ trước động vật ăn cỏ. Chúng đã được phát hiện ở nồng độ đáng kể trong thực phẩm thực vật, như trà thảo mộc, trà đen hoặc trà xanh, rau xanh lá, và sản phẩm mật ong. Trong mười năm qua, sự chú ý đối với sự hiện diện của PAs trong thực phẩm đã tăng lên, vì nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng độc hại gan cũng như khả năng gây gen và gây ung thư của chúng. Vì những lý do này, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu kết luận rằng PAs đại diện cho một mối lo nguy cơ sức khỏe nghiêm trọng và xếp hạng chúng trong số các chất trong thực phẩm đòi hỏi giám sát cẩn thận.1 Tuy nhiên, vẫn chưa có các ngưỡng pháp luật về nồng độ tối đa cho phép của PAs trong thực phẩm. Do đó, nguyên tắc chung chấp nhận ngày nay là giữ nồng độ PAs trong thực phẩm thấp nhất có thể được.2

Từ góc độ phân tích, PAs đại diện cho một nhóm hợp chất đặc biệt thách thức. Trong khi các giao thức cho chuẩn bị mẫu và phân tích đã có sẵn, phát hiện LC-MS/MS vẫn đặt ra nhiều thách thức, đặc biệt là PAs là một tập hợp của nhiều chất đồng đẳng không thể phân biệt bằng khối phổ một lần vì trọng lượng phân tử, cũng như khối lượng các phân tử fragment, không cụ thể cho từng hợp chất. Ngay cả với các công nghệ phân tách LC hiệu suất cực cao hiện đại, không thể tách một số chất đồng phân như indicine/lycopsamine/echinatine hoặc intermedine-N-oxide/indicine-N-oxide.

Trong bài ứng dụng này, một phương pháp sáng tạo để phân tích 27 alkaloid pyrrolizidine trong chiết xuất thảo mộc được trình bày sử dụng Hệ thống SCIEX QTRAP 6500+ trang bị Bộ phận phân tách dựa trên khác biệt về hệ số di động ion Differential Mobility Separation (DMS) SelexION+ (Hình 1). Phương pháp được trình bày bao gồm tất cả 17 PAs mà EFSA khuyến cáo giám sát trong thực phẩm, những PAs khác được BfR Đức đề xuất để phân tích định kỳ, và một số loài PAs đồng phân thêm.

Các đặc điểm quan trọng của Công nghệ SelexION+ cho việc phân tách alkaloid pyrrolizidine

• DMS sử dụng Công nghệ SelexION+ có khả năng phân biệt giữa các loại đồng phân mà không thể tách bằng sắc ký lỏng
• Công nghệ SelexION+ có thể được kết hợp với phân tích MRM trên Hệ thống QTRAP 6500+ để tạo ra một phương pháp định lượng nhanh chóng cho 27 alkaloid pyrrolizidine trong chiết xuất thảo mộc

2. Phương pháp phân tích Alkaloid pyrrolizidine

Chuẩn bị mẫu: Chiết xuất từ cây hồi, hoa cúc, và bạch chỉ được chuẩn bị như mô tả bởi Viện Đánh giá Rủi ro Liên bang Đức.3 Tóm tắt, alkaloid pyrrolizidine từ 2 g mẫu được chiết hai lần với 20 mL axit sulfuric 0,05M trong một bồn siêu âm. Sau quá trình ly tâm, lọc và điều chỉnh pH, lượng nhỏ chiết xuất được tinh chế và tập trung bằng cách sử dụng cột chiết xuất pha rắn C18. Dung dịch rửa giải được sấy khô dưới dòng khí nitơ, và phần còn lại được hoà tan lại trong 1 mL methanol nước 5%. Dung dịch chuẩn pha 180 μL plank mẫu được pha chế với 20 μL dung dịch chuẩn, tạo ra nồng độ cuối cùng từ 0,125 đến 25 ng/mL, tương ứng với 0,25 đến 50 ng PAs trên mỗi gram mẫu.

Sắc ký: Alkaloid pyrrolizidine được phân tách trên cột Phenomenex Luna® Omega C18 (100 x 2,1 mm; 1,6 μm), sử dụng Hệ thống SCIEX ExionLC AD. Pha động là 5 mM ammonium formate và 0,1% axit formic trong nước (A) và trong methanol (B), lần lượt. Nhiệt độ buồng cột được đặt ở 50 °C. Thể tích tiêm là 5 μL. Áp suất tối đa trong suốt quá trình sắc ký là <580 bar.

Khối phổ: Hệ thống SCIEX QTRAP 6500+ được trang bị Thiết bị DMS SelexION+. Phân tích được thực hiện ở cực dương với ion hóa bằng phun điện. Tham số MS được tối ưu hóa trên cột bằng cách tiêm dung dịch chuẩn với các cài đặt khác nhau. Tham số cuối cùng là như sau: nhiệt độ nguồn, 600 °C; Curtain gas, 20 psi (40 psi cho các thí nghiệm không sử dụng Thiết bị DMS SelexION+); GS1, 40 psi; GS2, 60 psi; điện áp phun ion, 4500V; khí CAD, 9 psi; điện áp vào, 10 V. Điện áp mất trắng, năng lượng va chạm và điện áp ra của cell được đặt tùy thuộc vào hợp chất. Điện áp phân tách, SV, của Thiết bị DMS SelexION+ được đặt ở 3800V. Isopropanol được liên tục phun vào dòng khí rèm tại 249 μL/phút. Ô phân tách ion được đun nóng đến 150 °C. Khí phân giải được đặt ở mức trung bình. Đối với mỗi chất phân tích, điện áp bù trọng của cụm DMS SelexION+ đã được tối ưu hóa được áp dụng. Dữ liệu được thu thập bằng cách sử dụng Thuật toán MRM^TM Đã Đặt lịch với thời gian quét mục tiêu là 0,6 giây sử dụng cửa sổ phát hiện MRM là 40 giây.

Sự phân tách LC của PAs

Cột Phenomenex Luna Omega Polar C18 với chiều dài 10 cm được sử dụng cho phân tích alkaloid pyrrolizidine trong chiết xuất trà thảo mộc và cho phép phân ly sắc ký của hầu hết các hợp chất ngoại trừ một số loại đồng phân (Hình 2). Việc sử dụng Công nghệ DMS SelexION+ đã tăng đáng kể sự chọn lọc của phương pháp này. Do đó, không cần phải phân giải hóa chất một cách hoàn toàn sắc ký và, vì vậy, thời gian chạy tổng cộng có thể được giảm xuống 12 phút.

Phân tách sử dụng DMS

Hình 3 cho thấy nguyên tắc của quá trình phân tách trong thiết bị ion hóa. Ô DMS được tạo ra từ hai tấm phẳng đồng song song và xác định một vùng di chuyển. Trong khi các ion được kéo theo dòng khí di chuyển về MS, nguồn điện cung cấp hai sóng sine với tần số khác nhau trên mỗi trong hai điện cực DMS, dẫn đến một trường điện động cao và thấp dao động (điện áp phân tách, SV). Do sự khác biệt giữa các hệ số di động ion trong điều kiện trường điện cao và thấp, ion sẽ di chuyển về phía các tường theo một đường sóng và rời khỏi đường bay trừ khi quỹ đạo của chúng được điều chỉnh bằng một điện áp cân bằng, một tiềm năng DC được gọi là điện áp bù trọng, COV. Điện áp bù trọng này rất cụ thể cho mỗi hợp chất và cho phép loại bỏ tác động từ ma trận và phân tách các chất đồng phân.

Điều chỉnh các thông số Công nghệ DMS SelexION+

Điều chỉnh các thông số Công nghệ DMS SelexION+ dễ dàng thực hiện bằng cách sử dụng infusion các tiêu chuẩn. Sau đó, điện áp bù trọng có thể được tăng dần trong khi biến đổi cài đặt cho các thông số khác như điện áp phân tách, khí phân giải hoặc thêm một dung môi biến đổi vào dòng khí curtain. Mục tiêu là có được sự phân tách tốt nhất của các chất đồng phân trong khi duy trì cường độ tối đa có thể.

Hình 4 thể hiện kết quả điều chỉnh cho một hỗn hợp tiêu chuẩn của intermedine, indicine, lycopsamine và echinatine, và các loài oxi hóa của chúng. Những chất phân tích này đặc biệt khó khăn trong phân tích LC-MS, vì chúng khó phân tách bằng sắc ký và, thêm vào đó, chúng có cùng các dòng chuyển động trong phân tích MS.

Cho cả các hợp chất không oxi hóa và oxi hóa, một sự mở rộng nhẹ của đỉnh được quan sát khi điện áp bù trọng được tăng dần ở các điện áp phân tách ngày càng tăng (Hình 4A), chỉ ra một sự phân tách bắt đầu, rất nhẹ của các chất đồng phân. Ở bước tiếp theo, khí phân giải được điều chỉnh, làm tăng thời gian lưu trú của các ion trong ô và do đó tăng độ phân giải của quá trình phân tách. Với dòng khí phân giải được đặt ở mức cao, cánh tay được phát hiện trên các tín hiệu cho cả hai nhóm chất phân tích, nhưng vẫn có sự chênh lệch giữa bốn chất đồng phân (Hình 4B).

Để cải thiện độ phân giải thêm nữa, isopropanol được sử dụng như một chất biến đổi và liên tục được phun vào dòng khí rèm. Vì dung môi tạo ra các cụm với ion chất phân tích, khả năng di động của chúng trong ô có thể được điều chỉnh đáng kể. Tìm ra chiến lược biến đổi phù hợp có thể dẫn đến một sự phân tách tốt hơn. Hình 4D thể hiện các bậc thang COV với các thiết lập SV khác nhau, với khí phân giải được đặt ở mức trung bình và isopropanol làm chất biến đổi. Với điện áp phân tách gia tăng, các enantiomers được phân tách tốt hơn lẫn nhau.

Trong thử nghiệm cuối cùng, sử dụng chất biến đổi isopropanol và một SV là 3800 V dựa trên các thử nghiệm trước đó, khí phân giải được điều chỉnh. Cài đặt trung bình là sự thoả thuận tốt nhất giữa sự phân tách đủ của các loại không oxi hóa và mất mát truyền của một số loại oxi hóa (Hình 4D).

Tăng độ chọn lọc với DMS

Trong khi indicine, lycopsamine và echinatine, cũng như indicine-N-oxide và intermedine-N-oxide, không thể phân tách bằng sắc ký (Hình 5A), chúng có thể dễ dàng phân giải khi sử dụng Công nghệ DMS SelexION+ (Hình 5B). Điện áp bù trọng cụ thể cho từng chất, xác định trong quá trình điều chỉnh Thiết bị DMS SelexION+, phục vụ như một tham số hiệu quả để tăng cường sự chọn lọc.

Tiếp theo, sự chọn lọc của việc sử dụng DMS với đa ion (Q1) được so sánh với phương pháp tiêu chuẩn MRM của ngành công nghiệp (Hình 6) sử dụng một chiết xuất bạch đàn. DMS cung cấp một sự tăng cường trong sự chọn lọc của quét Q1 MI so với một quét Q1 MI không có DMS và sự chọn lọc tương tự với thí nghiệm MRM cổ điển. Vì lý do này, được xem xét là đủ để theo dõi một chuyển động MRM đơn cho mỗi hợp chất PA khi làm việc với DMS, điều này cho phép tăng thời gian lưu trú và do đó cải thiện tín hiệu nhiễu ở nồng độ thấp.

Hình 7 chứng minh rằng Thiết bị DMS SelexION+ không chỉ phân tách các hợp chất đồng phân mà còn loại bỏ tác động từ ma trận. Như thể hiện trong Hình 7A, một hợp chất ma trận có sẵn trong chiết xuất mẫu bạch đàn đã xuất hiện rất gần với heliotrine-N-oxide, làm trở ngại cho việc định lượng chính xác và chính xác ở nồng độ thấp. Với Công nghệ DMS SelexION+, tuy nhiên, tác động được loại bỏ, cung cấp một chiết xuất trắng sạch để có thể tích hợp dễ dàng tín hiệu heliotrine-N-oxide. Như một ví dụ khác, dấu vết lasiocarpine-N-oxide cho thấy một mức nhiễu nền cao, trong khi nhiễu nền hoàn toàn bị loại bỏ với Công nghệ DMS SelexION+ (Hình 7B).

Độ nhạy và đồng tuyến của phân tích alkaloid pyrrolizidine trong chiết xuất thảo mộc

Với phương pháp cuối cùng sử dụng Hệ thống QTRAP 6500+ và Công nghệ DMS SelexION+, độ nhạy và độ tuyến tính đã được đánh giá cho 27 PAs trong chiết xuất thảo mộc. Tất cả các chất phân tích đã cho thấy độ nhạy tốt, với giới hạn phát hiện (LOD) nằm trong khoảng 0,02 đến 0,2 ng/mL, và giới hạn định lượng (LOQ) nằm trong khoảng 0,05 đến 0,5 ng/mL. Điều này đặc biệt quan trọng với các mẫu thực phẩm, vì PAs thường xuất hiện ở nồng độ rất thấp. Độ chính xác và độ lặp lại cũng đã được xác định dựa trên thang chuẩn chuẩn. Độ chính xác (theo phần trăm hồi quy) nằm trong khoảng 80-120% và độ lặp lại (RSD%) dưới 20%. Điều này chứng minh rằng phương pháp này là đáng tin cậy và có thể được sử dụng để định lượng chính xác PAs trong chiết xuất thảo mộc.

3. Kết luận

Phương pháp sáng tạo đã được phát triển để phân tích 27 alkaloid pyrrolizidine trong chiết xuất thảo mộc bằng Hệ thống QTRAP 6500+ và Công nghệ DMS SelexION+.

Sự chọn lọc bổ sung được đạt được bằng cách sử dụng DMS SelexION+, kết hợp với phổ học khối lượng MS/MS, tạo ra một phương pháp định lượng nhanh chóng và chính xác cho một loạt các PAs.

Sự chọn lọc của Công nghệ DMS SelexION+ đã cải thiện đáng kể khả năng phân giải của phương pháp, giảm thời gian chạy và loại bỏ tác động từ ma trận.

Phương pháp này đã được chứng minh là độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại, phù hợp để sử dụng trong việc giám sát chất lượng thảo mộc và thực phẩm dựa trên thảo mộc.