1. Giới thiệu
Một số lượng lớn các chất độc hại, chẳng hạn như thuốc trừ sâu, kháng sinh và độc tố, có nguồn gốc khác nhau và độc tính đối với sức khỏe con người được tìm thấy trong thực phẩm. Các hợp chất này thường có mặt ở nồng độ thấp trong các chất nền rất phức tạp, do đó, các phương pháp phát hiện có độ nhạy cao, có tính chọn lọc là cần thiết để phân tích chúng. Do tính chất hóa học của các hợp chất này, sắc ký lỏng (LC) là kỹ thuật tách được lựa chọn và việc ghép nối với phép đo khối phổ (MS) mang lại độ nhạy và độ chọn lọc cần thiết. Bài viết này đánh giá kỹ thuật phân tích của LC–MS/MS để phân tích các chất độc hữu cơ trong các sản phẩm thực phẩm. Chúng tôi cũng đề cập đến các khía cạnh công cụ, chẳng hạn như nguồn ion hóa và máy phân tích, cũng như các quy trình xác nhận và định lượng. Hơn nữa, chúng tôi thảo luận về việc áp dụng LC–MS/MS cho các hợp chất, chẳng hạn như thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất sinh ra trong quá trình nấu nướng và chất độc trong nhiều loại sản phẩm thực phẩm.
Các sản phẩm thực phẩm là những hỗn hợp phức tạp bao gồm các hợp chất tự nhiên như lipid, carbohydrate, protein, vitamin, hợp chất phenolic, axit hữu cơ và hương liệu. Ngoài ra, các chất khác, thường có nguồn gốc từ các quy trình công nghệ, xử lý hóa chất nông nghiệp hoặc vật liệu đóng gói, cũng thường có mặt. Mặc dù các hợp chất độc hại (thuốc trừ sâu, hydrocacbon thơm đa vòng (PAHs), hợp chất clo hóa và brom hóa, thuốc thú y, chất độc, hợp chất gây đột biến, chất di cư từ vật chứa, kim loại và hợp chất vô cơ có liên quan đến độc tính) có mặt với số lượng rất nhỏ, tuy nhiên chúng thường nguy hiểm cho sức khỏe con người. Thực tế này đã buộc các cơ quan lập pháp phải thiết lập các quy định chặt chẽ về giới hạn dư lượng tối đa (MRLs). Để tuân thủ các quy định này, cần có các kỹ thuật phân tích có tính chọn lọc cao để xác định và mô tả các hợp chất mục tiêu.
Các kỹ thuật tách, chẳng hạn như sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và điện di mao quản (CE), phần lớn được sử dụng để phân tích các hợp chất độc hại trong các mẫu thực phẩm. Độ phức tạp của chất nền thực phẩm thường không chỉ đòi hỏi phải chuẩn bị số lượng mẫu lớn mà còn cả các kỹ thuật ghép nối trực tuyến, được sử dụng để có khả năng tự động hóa vượt trội và năng suất cao. Các hệ thống phát hiện thường được sử dụng trong các kỹ thuật tách có thể ít nhiều chọn lọc và nhạy cảm nhưng thường thiếu thông tin liên quan đến việc nhận dạng các hợp chất. Việc sử dụng các kỹ thuật tách song song với phép đo khối phổ (MS) hoặc MS độ phân giải cao (thời gian bay, TOF) có thể khắc phục hạn chế này. Ngoài ra, do độ nhạy cao, các quy trình chuẩn bị mẫu có thể được đơn giản hóa, do đó dẫn đến các phương pháp xử lý nhanh hơn và ít tốn kém hơn.
GC kết hợp với MS (GC–MS) hiện là một kỹ thuật thông thường để phân tích các hợp chất thực phẩm không phân cực, bán cực, dễ bay hơi và bán dễ bay hơi, chẳng hạn như PAH, dioxin và PCB. Ngược lại, đối với các chất phân cực và không bay hơi, LC kết hợp với MS (LC-MS) là kỹ thuật được lựa chọn và trong những năm gần đây, kỹ thuật này đã được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực phân tích thực phẩm.Quá trình ion hóa phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) bổ sung cho nhau về tính phân cực, khối lượng phân tử của chất phân tích và điều kiện sắc ký. Tuy nhiên, ESI vẫn là nguồn ion hóa được sử dụng thường xuyên nhất để phân tích các hợp chất độc hại trong các sản phẩm thực phẩm do tính phân cực cao và đặc tính ion hóa của các chất này.
Trong khi GC–MS cung cấp phổ bằng cách ion hóa điện tử, kỹ thuật ion hóa áp suất khí quyển (API) thường tạo ra phổ không phân mảnh.
Phổ MS 2 lần (MS/MS), hoặc phân ly do va chạm tại nguồn (CID), được yêu cầu để có được thông tin cấu trúc, để cải thiện tính chọn lọc và độ nhạy, đồng thời để xác nhận danh tính của chất phân tích. Trong số các máy phân tích có khả năng phân tích MS/MS, các thiết bị ba tứ cực và bẫy ion được sử dụng phổ biến nhất để phân tích các hợp chất độc hại. Mặc dù MS/MS với các thiết bị lai, chẳng hạn như thời gian bay tứ cực (Q-TOF) có thể là một giải pháp thay thế tốt mang lại độ chính xác cao trong việc xác định khối lượng.
Hình 1. Hệ thống LC-MS/MS của Hãng Sciex
Mục đích của tổng quan này là trình bày các ứng dụng LC–MS/MS tiên tiến nhất hiện nay trong việc phân tích các chất độc hại trong các mẫu thực phẩm. Nó bao gồm tuyển tập các bài báo phù hợp nhất được xuất bản từ năm 2000 đến nay về các khía cạnh công cụ và phương pháp, cũng như các ứng dụng mới nhất. Các hợp chất hiện được phân tích bằng LC–MS/MS, chẳng hạn như thuốc trừ sâu, kháng sinh, chất tạo ra trong quá trình nấu nướng và chất độc, đã được chọn để thảo luận.
2. Thiết bị LC–MS/MS
2.1. nguồn ion hóa
Vì các chất độc hại trong các sản phẩm thực phẩm có thể bắt nguồn từ rất nhiều nguồn khác nhau nên các hợp chất này bao gồm nhiều cấu trúc hóa học khác nhau, từ các phân tử rất phức tạp, chẳng hạn như độc tố nấm mốc đến các phân tử nhỏ, chẳng hạn như chất điều hòa sinh trưởng thực vật . ESI và APCI là các kỹ thuật ion hóa hiện đang được LC–MS sử dụng để phân tích mẫu thực phẩm. Quá trình ion hóa quang áp suất khí quyển (APPI) gần đây đã được đề xuất để phân tích mẫu phức tạp, vì nó có thể khắc phục các vấn đề triệt tiêu gặp phải trong các nguồn APCI và ESI. Ví dụ, APPI gần đây đã được sử dụng trong phân tích LC–MS về thuốc trừ sâu carbamate trong trái cây và rau quả.
ESI là kỹ thuật ion hóa được khuyên dùng cho các hợp chất có trọng lượng phân tử cao và bị ion hóa, vì vậy nó thường được sử dụng để phân tích các chất độc trong thực phẩm. Đối với phân tích thực phẩm thông thường, các phương pháp LC-UV với các cột đường kính trong 3–4 mm đôi khi được điều chỉnh phù hợp với LC–MS bằng cách sử dụng các thiết bị phân tách để giảm tốc độ dòng pha động cần thiết để tách LC thích hợp thành dòng tối ưu cho phun điện. Vì phun điện tử phụ thuộc vào nồng độ, nên sự phân tách của dung dịch rửa giải sắc ký không ảnh hưởng nhiều đến độ nhạy. Cách tiếp cận này đã được sử dụng bởi van Vyncht et al. sử dụng để phân tích kháng sinh fluoroquinolone trong thận lợn bằng sắc ký pha đảo ngược sử dụng i.d 4 mm. cột và tốc độ dòng pha động là 1 mL/min. Bộ chia mảnh chữ T (9:1) được sử dụng để giảm tốc độ dòng chảy xuống 100 l/phút trước khi đưa nguồn ESI vào.
Người ta thường thừa nhận rằng phải tránh các pha động có độ bay hơi thấp và nước thải có nồng độ muối tương đối cao để ngăn chặn sự mất ổn định và tín hiệu kém. Tuy nhiên, các nguồn ESI hiện đại cho phép sử dụng các điều kiện bất lợi như vậy bằng cách cung cấp các biến thiết kế khác nhau, chẳng hạn như đặt dòng dung dịch được phun điện trực giao với mẫu. Vì hiệu quả phun điện phụ thuộc vào thành phần rửa giải, thành phần pha động tối ưu để phân tách sắc ký đầy đủ đôi khi không phù hợp để đạt được phản ứng phun điện tối đa. Tuy nhiên, việc lựa chọn chính xác dung môi sau cột để thêm vào nhằm thay đổi độ pH, hoặc để tăng tỷ lệ phần trăm dung môi hữu cơ, có thể tăng cường sự bay hơi ion và cải thiện tín hiệu (ví dụ: Castro et al. đã đề xuất việc bổ sung sau cột của metanol để tăng cường độ nhạy trong phân tích chlormequat điều hòa sinh trưởng thực vật trong các mẫu trái cây bằng phương pháp sắc ký pha đảo ngược cặp ion). Trong một ví dụ khác, Roach et al. đã đề xuất việc bổ sung 1% axit axetic trong 2-propanol sau cột để tránh các ion cản trở pha động trong quá trình phân tích acrylamide trong các sản phẩm thực phẩm khác nhau bằng sắc ký pha đảo.
APCI rất nhạy cảm với các hợp chất cơ bản yếu và thuốc trừ sâu, chẳng hạn như triazin và phenylurea, có thể dễ dàng bị proton bởi các ion pha khí, pha động, tùy theo ái lực với proton của chúng. APCI là một nguồn năng lượng cao hơn so với phun điện, vì nước thải được phun sương bằng dòng nitơ đồng trục và bay hơi nhanh chóng bằng cách sử dụng nhiệt độ cao (350–500oC). Những nhiệt độ cao này phải được tính đến khi làm việc với các hợp chất phân hủy nhiệt.
Nói chung, các ion có nguồn gốc từ các nguồn APCI tương ứng với các phân tử được proton hóa [M+H]+ ở chế độ ion hóa dương và các phân tử bị khử proton [M H] ở chế độ ion hóa âm. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, các tín hiệu bổ sung cho m/z tương ứng với các chất cộng Na+, K+ hoặc NH4+ xuất hiện trong quang phổ. Thật vậy, các cation này thường hiện diện dưới dạng tạp chất trong dung môi hữu cơ của pha động trong LC. Đôi khi, những chất gây nghiện này xuất hiện dưới dạng đỉnh cơ sở trong quang phổ. Ví dụ, trong phân tích LC-APCI-MS của carbamate và các loại thuốc trừ sâu phân cực khác trong trái cây và rau quả, các ion cộng amoni được quan sát thấy dưới dạng các đỉnh bazơ. Trong nghiên cứu cụ thể này, một số loại thuốc trừ sâu được phát hiện là các phân tử bị proton hóa và một số khác là các ion cộng.
Mặc dù các kỹ thuật APCI đại diện cho các chế độ ion hóa mềm, đôi khi các ion có thể bị phân mảnh trong nguồn để cung cấp thông tin về cấu trúc, mặc dù thu được độ nhạy thấp hơn và phổ phức tạp hơn so với MS/MS.
2.2. Khối phổ MS/MS
Như đã đề cập trong phần giới thiệu, trong số các máy quang phổ khối MS/MS có thể được kết hợp rộng rãi nhất với LC để phân tích các hợp chất độc hại trong các sản phẩm thực phẩm. Điều này chủ yếu là do hiệu suất vận hành dễ dàng hơn, độ bền tốt hơn cho phân tích thông thường và chi phí tương đối thấp khi so sánh với TOF hoặc thiết bị Cộng hưởng Cyclotron Biến đổi Ion Fourier (FT-ICR).
Máy phân tích ba tứ cực hiển thị độ nhạy cao khi làm việc ở chế độ theo dõi nhiều phản ứng (MRM), và do đó phù hợp nhất để thu được các MRL nghiêm ngặt được quy định đối với các hợp chất độc hại khác nhau trong các nền thực phẩm khác nhau. Ví dụ: khi phân tích kháng sinh chloramphenicol trong sữa bò bằng LC–MS/MS, LOD là 15 ng/kg thu được bằng cách sử dụng quá trình chuyển đổi phong phú nhất (m/z 321–152). Trong trường hợp chloramphenicol trong sữa bò, LOD tăng lên 30 ng/kg, mặc dù đó không phải là vấn đề vì giá trị này thấp hơn 10 lần so với giá trị MRL tương ứng.
3. Khía cạnh định danh và định lượng
Để tuân thủ các quy định đã được thiết lập, cả việc xác định và định lượng chính xác các chất cần phân tích ở mức vết đều là bắt buộc. Mặc dù MS/MS thể hiện độ nhạy và độ chọn lọc cao hơn, nhưng việc xác nhận chất phân tích không phải lúc nào cũng hoàn toàn đạt được. Hầu hết các ứng dụng của LC–MS/MS được tìm thấy trong tài liệu về phân tích mẫu thực phẩm chỉ giám sát một quá trình chuyển đổi cho mỗi hợp chất mục tiêu, mặc dù luật hiện hành yêu cầu nhiều hơn một chuyển đổi để xác nhận sự có mặt của chất phân tích.
Hình 2. (a) Cấu trúc của các đồng phân AZA4 (R1 = OH, R2 = H, R3 = H, R4 = H) và AZA5 (R1 = H, R2 = H, R3 = H, R4 = OH). Biểu đồ bên trái biểu thị đường dẫn phân mảnh MS đặc trưng. (b) (A) Sắc ký đồ thể hiện sự phân tách các đồng phân thu được bằng LC–MS3; AZA4 (3,73 phút) và AZA5 (4,63 phút). (B) và (C) lần lượt là khối phổ tương ứng với AZA4 và AZA5. Điều kiện sắc ký: Cột Luna-2-C18 (5 lm, 150 · 2,0 mm) ở 40 C, axetonitril–nước (46:54) với 0,5 mM amoni axetat và 0,05% TFA là pha động. ESI ở chế độ ion hóa dương
Ngay cả khi sử dụng LC–MS/MS, các hiệu ứng nền phải được tính đến, đặc biệt khi nghiên cứu các mẫu phức tạp, chẳng hạn như thực phẩm. Nói chung, các phương pháp xác định đa dư lượng với xử lý mẫu đơn giản thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm để giảm thời gian phân tích. Tuy nhiên, việc đơn giản hóa quy trình làm sạch có thể dẫn đến chất chiết bẩn có hàm lượng chất đồng chiết cao. Vấn đề chính của việc phân tích các mẫu này bằng LC–MS là xảy ra hiện tượng triệt tiêu tín hiệu, đặc biệt là với các nguồn phun điện. Ví dụ, tín hiệu giảm 10-50% đối với hai loại thuốc trừ sâu, carbendazim và thiabendazole, được quan sát bởi Jansson et al. sử dụng phương pháp đa dư lượng để phân tích thuốc trừ sâu đối với trái cây và rau quả. Các tác giả này đã phân tích dâu tây được tẩm hỗn hợp gồm năm loại thuốc trừ sâu bằng cách sử dụng phương pháp chiết xuất đơn giản với etyl axetat, sau đó bơm dịch chiết trực tiếp vào hệ thống LC–MS/MS. Hình 3 so sánh sắc ký đồ thu được sau khi chiết với sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn được điều chế trong metanol ở cùng mức nồng độ, cho thấy phản ứng giảm đối với một số hợp chất.
Hình 3. Ví dụ về ức chế thuốc trừ sâu. Tiêm thuốc trừ sâu 0,05 mg/kg vào quả dâu tây, phủ cùng loại thuốc trừ sâu đó trong metanol và sắc ký đồ trắng của quả dâu tây. Thời gian lưu thuốc trừ sâu trong dâu tây (—) di chuyển thủ công 0,3 phút; thời gian lưu thực sự giống hệt nhau. Chỉ có đỉnh không. 2 và không. 3 bị triệt tiêu. LC-ESI-MS/MS ở chế độ ion hóa dương. Đỉnh 1: ethiofencarb-sulphoxide; 2: carbendazim; 3: thiabendazol; 4: propoxur; 5: carbaryl.
3. Kết Luận
Phân tích các chất độc hại trong mẫu thực phẩm bằng LC kết hợp với MS/MS cho thấy kỹ thuật này đã trở thành một công cụ mạnh mẽ trong kiểm soát chất lượng sản phẩm thực phẩm và bảo vệ sức khỏe con người. Tuy nhiên, việc phân tích các hợp chất này không phải là một nhiệm vụ đơn giản do sự phức tạp của chất nền, đòi hỏi các quy trình làm sạch toàn diện nếu muốn thu được định lượng mẫu chính xác. Nói chung, một bước trích xuất tiếp theo là làm sạch bằng SPE được thực hiện và chỉ trong một số trường hợp hiếm hoi mới có thể tiêm trực tiếp phần trích xuất ban đầu.
ESI là nguồn ion hóa được sử dụng thường xuyên nhất do độ nhạy cao hơn đối với các hợp chất độc hại, hầu hết chúng dễ dàng bị ion hóa trong pha lỏng. Tuy nhiên, đối với một số hợp chất, kết quả tốt hơn thu được khi sử dụng APCI, cho thấy rằng cả hai nguồn API nên được xem xét khi thiết lập các phương pháp phân tích thực phẩm mới.
Mặc dù cả hai thiết bị bẫy ion và ba tứ cực thường được sử dụng trong lĩnh vực này, nhưng thiết bị sau thường gặp hơn, vì LOD thấp hơn của nó cho phép tuân thủ các MRL nghiêm ngặt do cơ quan quản lý đặt ra. Các khía cạnh liên quan đến việc xác nhận rõ ràng các hợp chất độc hại cũng phải được đề cập. Ví dụ, trong bẫy ion, quét ion sản phẩm cho phép xác nhận các chất phân tích, trong khi ở dạng ba bốn lần thì phải thu được ít nhất hai chuyển tiếp ion sản phẩm ion tiền chất. Đối với phân tích đa dư lượng, có thể theo dõi số lượng hợp chất lớn hơn bằng cách sử dụng thiết bị ba bốn cực mặc dù sự gia tăng LOD thường được quan sát thấy. Một ưu điểm nữa của các dụng cụ bẫy ion là chúng có tính chọn lọc cao, sử dụng MS nhiều bước, có thể tránh nhiễu.
Đối với các mục đích định lượng, pha loãng đồng vị được sử dụng trong những trường hợp phải xác định một số lượng nhỏ các hợp chất. Đối với phân tích đa dư lượng, phương pháp phù hợp với nền được khuyến nghị, vì hiện tại không có tiêu chuẩn được dán nhãn cho tất cả các chất phân tích. Hiệu chuẩn bên ngoài hiếm khi được sử dụng và sau đó chỉ được đề xuất cho thuốc trừ sâu trong các chất nền đơn giản, chẳng hạn như rau và trái cây, và luôn luôn sau khi chứng minh rằng không có hiệu ứng chất nền nào xảy ra.
Để phân tích thông thường các hợp chất trong sản phẩm thực phẩm, phân tích khối phổ như ba tứ cực và LC-MS/MS trong bẫy ion, mới được sử dụng phổ biến. Những thiết bị này mang lại những lợi thế, chẳng hạn như tốc độ quét cao, phép đo khối lượng chính xác (TOF) và tăng độ nhạy (bẫy tuyến tính và bộ ba tứ cực thế hệ mới). Chắc chắn khả năng ứng dụng của chúng vào lĩnh vực này sẽ được chứng minh trong tương lai gần.
Tài liệu tham khảo:
[1] L. Mondello, G. Dugo, P. Dugo, LC–GC Eur. 2 November (2002) 2.
[2] M. Guilhaus, Time-of-flight mass spectrometry for the new millennium, in: E. Gelpi (Editor), Advances in Mass Spectrometry, vol. 15, Wiley, Chichester, West Sussex, UK, 2001, p. 19.
[3] M. Careri, F. Bianchi, C. Corradini, J. Chromatogr. A 970 (2002) 3.
[4] A. Di Corcia, M. Nazzari, J. Chromatogr. A 974 (2002) 53.
[5] Y. Pico, C. Blasco, G. Font, Mass. Spectrom. Rev. 23 (2004) 45.
[6] M. Lehane, A. Bran˜a-Magdalena, C. Moroney, A. Furey, K.J. James, J. Chromatogr. A 950 (2002) 139.
[7] R. Castro, E. Moyano, M.T. Galceran, J. AOAC. Int. 84 (2001) 1908.
[8] M. Takino, K. Yamaguchi, T. Nakahara, J. Agric. Food Chem. 52 (2004) 727.
[9] B. Toussaint, G. Bordin, A. Janosi, A.R. Rodriguez, J. Chromatogr. A 976 (2002) 195.
[10] A.C. Hogenboom, M.P. Hofman, S.J. Kok, W.M.A. Niessen, U.A.Th. Brinkman, J. Chromatogr. A 892 (2000) 379.
[11] M.J. Taylor, K. Hunter, K.B. Hunter, D. Lindsay, S.L. Bouhellec, J. Chromatogr. A 982 (2002) 225.
[12] G. van Vyncht, A. Ja`nosi, G. Bordin, B. Toussaint, G. MaghuinRogister, E. De Pauw, A.R. Rodriguez, J. Chromatogr. A 952 (2002) 121.
[13] S. Riediker, R.H. Stadler, J. Chromatogr. A 1020 (2003) 121.
[14] A. Lagana, R. Curini, G. DAscenzo, I. De Leva, A. Faberi, E. Pastorini, Rapid Commun. Mass Spectrom. 17 (2003) 1037.
[15] S.D. West, M.J. Hastings, D.D. Shackelford, G.E. Dial, J. Agric. Food Chem. 52 (2004) 5781.
[16] J.A.G. Roach, D. Andrzejewski, M.L. Gay, D. Nortrup, S.M. Musser, J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 7547.
[17] H. Nakazawa, S. Ino, K. Kato, T. Watanabe, Y. Ito, H. Oka, J. Chromatogr. B 732 (1999) 55.
[18] K. Granby, J.H. Andersen, H.B. Christensen, Anal. Chim. Acta 520 (2004) 165.
[19] O. Nu´n˜ ez, E. Moyano, M.T. Galceran, J. Mass Spectrom. 39 (2004) 873.
[20] E. Barcelo´-Barrachina, E. Moyano, M.T. Galceran, J. Chromatogr. A 1054 (2004) 409
| CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI – DỊCH VỤ – KỸ THUẬT VIỆT NGUYỄN | |
| Địa chỉ | VPHCM: số N36, đường số 11, P. Tân Thới Nhất, Q.12, Tp. Hồ Chí Minh
VPĐN: Số 10 Lỗ Giáng 5, phường Hòa Xuân, quận Cẩm Lệ, Tp. Đà Nẵng VPHN: 138 Phúc Diễn, P. Xuân Phương, Q. Nam Từ Liêm, Tp. Hà Nội VP Cần Thơ: 275 Xuân Thủy, P. An Bình, Q. Ninh Kiều, Tp. Cần Thơ |
| Hotline | PHÒNG MARKETING – TRUYỀN THÔNG:
|
| info@vietnguyenco.vn | |
| Website | https://www.vietcalib.vn| https://www.vietnguyenco.vn |
