1. Giới thiệu
Một phương pháp phân tích phát hiện đa lớp, đa dư lượng (analytical multiclass, multi-residue method) để xác định kháng sinh trong các sản phẩm nuôi trồng thủy sản đã được phát triển và công nhận. Một quy trình chiết xuất nhanh, rẻ và đơn giản, tiếp theo là phân tích sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS) đã được đề xuất. Phương pháp này bao gồm 32 loại kháng sinh thuộc các nhóm khác nhau, thường được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Ba quy trình chiết xuất khác nhau được so sánh và quy trình chiết xuất bằng acetonitril (acid formic 0,1%) cho kết quả tốt nhất. Quy trình chiết xuất được chọn đã được kiểm chứng ở bốn mức độ khác nhau (10 μg kg−1, 25 μg kg−1, 50 μg kg−1 và 100 μg kg−1). Khả năng phục hồi của các loại kháng sinh được thử nghiệm dao động từ 70% đến 120%, với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của ba lần thấp hơn 20%. Giới hạn định lượng (LOQ) nằm trong khoảng từ 0,062 μg kg−1 đến 4. 6 μg kg−1, cho phép phân tích lượng vết của các loại kháng sinh này trong các sản phẩm nuôi trồng thủy sản. Phương pháp này được áp dụng để phân tích các loại kháng sinh chọn lọc trong thịt cá và tôm có bán trên thị trường.
Hầu hết các phương pháp thủ công xác định kháng sinh trong thủy sản đã công bố đều tập trung vào một hoặc hai nhóm kháng sinh. Tuy nhiên, chiến lược phân tích hiện tại đang chuyển sang phương pháp phát hiện đồng thời, giúp tiết kiệm thời gian vì tất cả các mục tiêu của tibiotics đều được phân tích trong mộtlần c hạy. Hiện tại, các phương pháp như vậy là không phổ biến.
Mục đích của nghiên cứu này là phát triển một phương pháp tiền xử lý mẫu đơn giản và nhanh chóng, phù hợp để
xác định nhiều loại dư lượng kháng sinh từ các sản phẩm nuôi trồng thủy sản khác nhau. Các nhóm kháng sinh phổ biến nhất được sử dụng để điều trị bệnh cho cá, cũng như các loại kháng sinh bị cấm, được lựa chọn dựa trên luật pháp và việc sử dụng chúng trong nuôi trồng thủy sản. Tổng cộng, 32 loại kháng sinh đã được phân tích, bao gồm 8
fluoroquinolones, 13 sulfonamid, 2 tetracy clines, 3 macrolide, 2 beta-lactam, 2 ampheni cols, 1 lincosamide,
penicillin, 1 kháng khuẩn (bacteriostatic antibiotic) và 1 kháng virus (antiviral). Tất cả các kháng sinh được chọn đã được phân tích trong một lần chạy. Phương pháp này đã được xác định giá trị xác định độ tuyến tính, độ chính xác, độ lặp lại và giới hạn định lượng (LOQ) của nó. Sau đó, phương pháp này đã được áp dụng để phân tích dư lượng kháng sinh trong các mẫu cá và tôm có mặt tại thị trường.
2. Tiến hành phân tích
Hóa chất chạy LC-MS/MS, thuốc thử và nước tinh kiết được sử dụng tất cả được sử dụng có độ tinh khiết tiêu chuẩn phân tích hoặc hàm lượng > 98% của hợp chất mục tiêu.
Bốn hợp chất đánh dấu khối lượng được sử dụng làm chất chuẩn nội: trimethoprim, sulfamethoxazole, carbamazepine và amitriptyline. Trimethoprim (13C3) và sulfamethox azole (13C6) được mua từ Phòng thí nghiệm Cambridge (Andover, MA, USA); carbamazepine (D10) và amitriptyline (D6) được mua từ CDN (Pointe-Claire,
Quebec, Canada). Dung dịch gốc của tất cả các loại kháng sinh được chuẩn bị trong metanol ở nồng độ 1 mg mL-1 và được bảo quản ở –20oC. Hỗn hợp thêm chuẩn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch gốc trong metanol đến nồng độ cuối cùng là 1 µg mL-1 cho mỗi loại. hợp chất, và nó được bảo quản ở –20oC.
Pha động bao gồm nước (dung môi A) và axetonitril (dung môi B). Cả hai pha đều được aicd hóa với 0,1% acid formic. Gradient như trong Bảng 1. Có rất ít phương pháp bao gồm tất cả các loại kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản. Trong số các phương pháp phân tích đồng thời đã công bố áp dụng cho thực phẩm, có nhiều phương pháp xử lý các ma trận khác với cá. Phun điện âm gia nhiệt ở chế độ ion dương và âm (amphenicoles only) được sử dụng để ion hóa các hợp chất mục tiêu. Các thông số chính được đặt như sau: điện áp ion hóa ở 3,5 kV ở chế độ dương và 2,7 kV ở chế độ âm, khí vỏ bọc ở 35 đơn vị tùy ý và khí phụ trợ ở 15 đơn vị tùy ý, nhiệt độ hóa hơi ở 250oC và nhiệt độ mao quản ở 350oC. Cả tứ cực thứ nhất và thứ ba đều được vận hành ở độ phân giải 0,7 FMWH. Hai quá trình chuyển đổi SRM đã được theo dõi cho từng chất phân tích. Tất cả các chi tiết của phương pháp phân tích (sự chuyển đổi khối lượng – m/z, năng lượng va chạm và thời gian lưu) được trình bày trong Bảng S1 (ESM). Sắc ký đồ cho các hợp chất mục tiêu được trình bày trong Hình 1 và 2.
Chuẩn bị và phân tích mẫu
Thịt cá (0,5 g) được cân trong ống Eppendorf và một lượng chất chuẩn thay thế nhất định đã được thêm vào. Đảm bảo chất lượng/kiểm soát chất lượng và các mẫu phát triển phương pháp được củng cố bằng các hợp chất mục tiêu. Việc đối chứng được thực hiện ở mức 100 µg kg-1. Mẫu trắng và mẫu thử nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.
Bảng 1. Gradient LC đối với quá trình rửa giải các hợp chất mục tiêu
Sau khi thêm 1 mL hỗn hợp chiết xuất, các mẫu được đồng nhất hóa ở tốc độ 30000 phút-1 trong 5 phút. Sau đó, chúng được ly tâm ở 10000 phút-1 và 4oC trong 10 phút; và sau đó, phần nổi phía trên được lọc qua bộ lọc ống tiêm cellulose 0,45 µm. Các vùng trích xuất được làm bay hơi đến khoảng 50 µL và 5 µL của mỗi dịch chiết được phân tích bằng LC-MS/MS.
Để có được độ thu hồi thích hợp, các dung dịch chiết khác nhau (metanol, nước, acetonitril) và các nồng độ acid formic khác nhau đã được thử nghiệm. Thành phần của các hỗn hợp chiết xuất được mô tả chi tiết trong phần Kết quả và thảo luận.
Phương pháp đã được xác nhận xác định tính tuyến tính, độ chính xác, độ lặp lại và giới hạn định lượng (LOQ) của nó ở mức độ quan tâm. Các mức bổ sung là 10 µg/kg, 25 µg/kg, 50 µg/kg và 100 µg/kg. Việc xác nhận được thực hiện bằng cách sử dụng thịt cá trắng từ cá chép (Cyprinus carpio), cá rô phi (Ore ochromis niloticus) và tôm (Metapenaeus ensis). Để kiểm tra khả năng ứng dụng của phương pháp được đề xuất, 97 mẫu cá và tôm thật được mua tại các siêu thị địa phương đã được kiểm tra sự hiện diện của kháng sinh.
3. Kết quả và thảo luận
Tối ưu hóa quy trình ly trích
Các tổ hợp dung môi chiết khác nhau đã được thử nghiệm: nước/metanol 50/50 ((ϕr = 50 : 50), nước/metanol
30/70 (ϕr = 30 : 70) và acetonitril. Sử dụng nước/metanol 50/50 làm dung môi chiết dẫn đến dịch chiết bị đục, không đủ sạch để phân tích bằng LC-MS/MS.
Quá trình chiết hai bước với hỗn hợp nước/metanol tỷ lệ 30/70 và axetonitril được thực hiện như sau: Đầu tiên, 1 mL nước/methanol 30/70 được thêm vào mẫu. Hỗn hợp được ly tâm và phần nổi phía trên được gạn cẩn thận. Sau đó, 1 mL tonitril (ACN) được acid hóa với 0,1% acid formic (FA) được thêm vào phần cặn và quy trình được lặp lại. Phần nổi phía trên thu được đã được thêm vào phần nổi phía trên của bước trước đó. Dịch chiết cá thu được bằng phương pháp chiết xuất hai bước đủ sạch để phân tích LC-MS/MS. Cuối cùng, acetonitril đã acid hóa được sử dụng làm dung môi chiết xuất. Hai nồng độ acid formic đã được thử nghiệm: 0,1% và 1%.
Việc đồng chiết xuất các thành phần các thành phần có số lượng lớn như chất béo và protein là điều không mong muốn vì nó có thể gây ra các vấn đề về ion hóa, và do đó dẫn đến ức chế hoặc tăng cường ion. Để loại bỏ phospholipid, chất nổi phía trên được làm sạch bằng cách sử dụng cột HybridSPE-Phospholipid dựa trên silica được phủ zirconia. Khi áp dụng chân không, các phân tử mục tiêu nhỏ sẽ đi qua, trong khi các protein và phospholipid kết tủa được giữ lại trong pha SPE lai. Quy trình này đã được Monko mô tả chi tiết (Monko, 2011) (Monko, M. (2011). (Selective phospholipid extractions for cleanup or enrichment using HybridSPE-Phospholipid. Reporter, 45(March), 16–17.).
Trong số các dung môi chiết được thử nghiệm, acetonitril cho kết quả tốt nhất. Quá trình chiết xuất bằng axetonitril (0,1 thể tích % FA) sau đó là quy trình làm sạch với các cột HybridSPE-Phospholipid đã cho khả năng thu hồi thỏa đáng hầu hết các chất phân tích đích. Thu hồi thấp không thể chấp nhận được đối với bảy loại kháng sinh từ nhóm fluoroquinolone (ciprofloxacin, enrofloxacin, levofloxacin, norfloxacin, difloxacin, enoxacin, axit oxolinic) và đối với hai loại tetracycline (tetracycline và oxytetracycline). Những loại kháng sinh này rất được quan tâm để phân tích các sản phẩm nuôi trồng thủy sản. Việc sử dụng tetracycline được cho phép trong nuôi trồng thủy sản. Liên quan đến fluoroquinolones, một số trong số chúng được phép sử dụng trong thú y trong khi những loại khác chỉ được sử dụng để điều trị cho con người. Hơn nữa, do tính bền vững cao, fluoroquinolones (ngoại trừ flumequine và axit oxolinic) bị cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ở Hoa Kỳ, Úc và Canada.
Các hợp chất được đề cập ở trên được tìm thấy trong dịch chiết mẫu không trải qua quy trình làm sạch. Điều này
cho thấy rằng một số kháng sinh đã bị giữ lại trong pha silica phủ zirconia của các cột HybridSPE. Khi bước làm
sạch bị bỏ qua, khả năng phát hiện của tất cả các loại kháng sinh nằm trong khoảng là 70–120%, ngoại trừ amoxicillin có tỷ lệ phát hiện tồn dư là 50%. Kết quả của việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất cho kết quả đáng ghi nhận của kháng sinh được thể hiện trong Hình 1 và 2. Việc so sánh các quy trình chiết xuất khác nhau được thực hiện ở nồng độ kháng sinh tương đối cao (100 µg/kg). Để kiểm tra sự phù hợp của phương pháp chiết xuất đã chọn, việc xác nhận được thực hiện ở nồng độ kháng sinh thấp hơn (xem phần Giá trị của phương pháp).
Hình 1. Thu hồi (%) kháng sinh đại diện từ mô cá sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau
Hình 2. Thu hồi (%) kháng sinh đại diện từ mô cá bằng các dung môi chiết xuất khác nhau
Do đó, quy trình chiết xuất bằng acetonitril được acid hóa với 0,1% FA được chọn để phân tích. Bước làm sạch bị bỏ qua vì làm thất thoát một số chất kháng sinh đang được quan tâm. Đường chuẩn năm điểm được chuẩn bị bằng cách bổ sung dịch chiết thịt cá sạch với các thành phần phân tích trong khoảng nồng độ từ 1 µg kg-1 đến 250 µg/kg, cộng với nồng độ không đổi của chất nội chuẩn (50 µg/kg). Các mẫu chuẩn phù hợp trải qua quy trình chiết giống như các mẫu khác. Thêm một điểm hiệu chuẩn (600 µg/kg) đã được chuẩn bị đặc biệt cho flumequine, vì đây là hợp chất duy nhất có MRL cao. Tất cả các chất phân tích cho thấy độ tuyến tính tốt trong khoảng thời gian được nghiên
cứu, với giá trị R2 cao hơn 0,995 đối với hầu hết các chất phân tích. Các tham số của đường chuẩn được trình bày
trong Bảng S3 (ESM). Hơn nữa, việc bỏ qua bước làm sạch này khiến quy trình trở nên đơn giản và nhanh chóng, với quy trình xử lý khoảng 100 mẫu trong một ngày.
Tối ưu hóa cường độ tín hiệu
Nhiều loại kháng sinh cần được có một quy trình chiết xuất từ thịt cá một cách hiệu quả nhất có thể. Mặt khác, việc đồng chiết xuất các thành phần phức tạp như chất béo và protein là điều không mong muốn. Chất nền có thể làm giảm tuổi thọ của cột phân tích và nó thường gây ra sự ức chế hoặc tăng cường ion hóa trong quá trình phân tích MS/MS.
Để kiểm tra hiệu ứng nền có thể xảy ra, các hệ số đáp ứng của các chất chuẩn hiệu chuẩn trong dung môi được so
sánh với các hệ số đáp ứng của các hợp chất đích có trong dịch chiết cá đối chứng (Blank) (các chất chuẩn phù hợp với nền).
Các hiệu ứng nền phức tạp quan sát được tóm tắt trong Bảng 2 (ESM). Mặc dù thể tích tiêm thấp (5 µL), các hiệu ứng nền đáng kể (hơn 20%, được đánh dấu đậm trong bảng) đã được quan sát đối với hầu hết các chất phân tích. Chỉ có 12 trong số 32 hợp chất mục tiêu dường như không bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng nền. Số lượng bằng nhau các chất phân tích bị ức chế hoặc tăng cường, nhưng sự khác biệt lớn hơn so với dung môi chuẩn được quan sát bằng các chất tăng cường, đặc biệt là đối với một số kháng sinh từ nhóm fluoroquinolone.
Rõ ràng, các tiêu chuẩn phù hợp với nền phải được sử dụng để định lượng chính xác các hợp chất mục tiêu trong
các mẫu thực.
Phương pháp xác nhận
Xác nhận phương pháp được dựa trên đánh giá của độ tuyến tính, độ chính xác, độ lặp lại và giới hạn định lượng.
Đường chuẩn năm điểm được chuẩn bị bằng cách bổ sung dịch chiết cơ cá trống với các thành phần đích trong khoảng nồng độ từ 1 µg.kg-1 đến 250 µg.kg-1, cộng với nồng độ không đổi của chất nội chuẩn (50 µg.kg-1). Các mẫu chuẩn phù hợp với mẫu trải qua quy trình chiết giống như các mẫu khác. Thêm một điểm hiệu chuẩn (600 µg.kg-1) đã được chuẩn bị đặc biệt cho flumequine, vì đây là hợp chất duy nhất có MRL. Tất cả các chất phân tích cho thấy độ tuyến tính tốt trong khoảng thời gian được nghiên cứu, với giá trị R2 cao hơn 0,995 đối với hầu hết các chất phân tích. Các tham số của đường chuẩn được trình bày trong Bảng 3 (ESM).
Độ chính xác của phương pháp đã được kiểm tra bằng cách đánh giá khả năng phục hồi của các hợp chất mục tiêu từ các mẫu nghiên cứu. Các mẫu cá trắng (Blank) được bổ sung hỗn hợp kháng sinh mục tiêu ở các mức độ khác nhau. Theo Chỉ thị Châu Âu 96/23/EC, mức độ quan tâm phải tương ứng với tiêu chuẩn giá trị MRL. Trong số các loại kháng sinh được chọn có MRL cố định, trimethoprim, amoxicillin và ampicillin có MRL thấp nhất (50 µg.kg-1). Chloramphenicol không có MRL, vì đây là
hợp chất bị cấm. Để xác thực khả năng thu hồi, các mức bổ sung sau đây đã được chọn: 10 µg.kg-1, 25 µg.kg-1, 50 µg.kg-1 và 100 µg.kg-1 (một điểm nữa, 600 µg.kg-1, đã được đưa vào cho flumequine). Quy tắc đã thiết lập về việc tăng đột biến ở mức 0.5-, 1- và 1.5- lần giá trị MRL đã không được tuân thủ.
Bảng 2. Các tham số xác thực phương pháp LC-MS/MS đã phát triển
Mục đích chính không chỉ là so sánh nồng độ đo được với các giới hạn đã đặt để đánh giá rủi ro sức khỏe con người, mà còn để đạt được mức phát hiện thấp nhất có thể cho các nghiên cứu tích lũy sinh học tiếp theo của các hợp chất có hoạt tính dược lý, vì chúng hiện được công nhận là mới nổi. chất ô nhiễm trong môi trường.
Các mẫu với ba lần lặp lại đã được chuẩn bị cho nghiên cứu. Độ thu hồi của tất cả các hợp chất mục tiêu, ở các mức bổ sung và giới hạn định lượng (LOQ) khác nhau, được trình bày trong Bảng 2. Giá trị thu được mức vết, độ thu hồi nằm trong khoảng 70–120 % đối với tất cả các chất phân tích đích, ngoại trừ amoxicillin, có độ che phủ 42–52 %. Vì lý do này, amoxicillin đã bị loại khỏi phương pháp phân tích.
Độ lặp lại được đánh giá ở bốn mức nồng độ. Các mẫu ba lần đã được chuẩn bị cho từng cấp độ. Độ lệch chuẩn
tương đối (RSD) của kết quả thí nghiệm với ba lần lặp lại được đưa ra trong bảng 2.
RSD thấp hơn 20% đối với tất cả các loại kháng sinh mục tiêu. Dữ liệu về độ chính xác trong ngày và giữa các ngày đối với các yếu tố phản hồi trung bình và thời gian lưu được đưa ra trong bảng 4.
LOQ được tính bằng cách phân tích các mẫu balnk tăng vọt ở nồng độ thấp (0.5 – 10 µg kg-1).
LOQ nằm trong khoảng từ 0,062 µg kg-1 đối với oxytetracycline đến 4,6 µg kg-1 đối với sulfamethazine, cho phép phân tích các loại kháng sinh này trong các sản phẩm nuôi trồng thủy sản ở mức vết.
Hạn chế duy nhất của phương pháp liên quan đến chloramphenicol. Vì việc sử dụng chất này là bị cấm trong nuôi trồng thủy sản, hướng dẫn đặt ra các giới hạn hiệu suất yêu cầu tối thiểu (MRPL) cho phân tích của nó. Các MRLP đối với chloramphenicol trong các sản phẩm nuôi trồng thủy sản là 0,3 µg kg-1 (Ủy ban Châu Âu, 2003).
Bảng 3. Các mẫu cá được phân tích trong nghiên cứu
Bảng 4. Nồng độ kháng sinh trong mẫu dương tính và MRL quy định tại EU
Ứng dụng của phương pháp phân tích
Phương pháp đề xuất được sử dụng để phân tích 97 mẫu cá và tôm có bán trên thị trường tại Cộng hòa Séc (CR). Số lượng mẫu chính xác cho từng loài cá được trình bày trong Bảng 3.
Các mẫu cá và tôm được mua từ ba siêu thị lớn nhất ở České Budějovice, thuộc mạng lưới các cửa hàng bao phủ toàn CR. Các mẫu cá tự nhiên và cá nuôi (cá chép, cá hồi, cá hồi, cá rô phi, cá tra, v.v.), tôm nước ngoài (Châu Âu,Châu Á, Châu Phi) và Séc đã được lấy. Đây là nghiên cứu đầu tiên thuộc loại này về CR bao gồm nhiều loại hợp chất, không chỉ những hợp chất có MRL cố định, và tập trung vào cả cá nuôi và cá trong tự nhiên.
Trong số 97 mẫu được phân tích, 15 mẫu dương tính với ít nhất một loại kháng sinh được thử nghiệm (Bảng 4). Loại kháng sinh được tìm thấy nhiều nhất là flume quine,được phát hiện 9 trong số 15 mẫu dương tính. Các loại kháng sinh khác thuộc họ quinolone cũng phổ biến, có mặt ở 12 trong số 15 mẫu. Nồng độ của tất cả các loại kháng sinh được phát hiện được trình bày trong Bảng 4. Tất cả các giá trị đều thấp hơn MRL quy định.
4. Kết luận
Bài báo này mô tả phương pháp LC-MS/MS để xác định đồng thời 32 loại kháng sinh thuộc các nhóm khác nhau trong các sản phẩm nuôi trồng thủy sản. Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và không yêu cầu bất kỳ quy trình làm sạch nào, cho phép đặt lượng mẫu được phân tích nhiều. Việc sử dụng các chất chuẩn phù hợp với mẫu phân tích được khuyến nghị để loại bỏ hiệu ứng nề phức tạp. Phương pháp đã chứng minh các thông số hiệu suất tuyệt vời. Độ che phủ của tất cả các loại kháng sinh, ở mức tăng cường 10 µg kg-1, nằm trong khoảng từ 70% đến 120%.
LOQ nằm trong khoảng từ 0,062 µg kg-1 đến 4,6 µg kg-1. Phương pháp này cho phép xác định hàm lượng vết của các loại kháng sinh được chọn trong các sản phẩm nuôi trồng thủy sản.
Tham khảo từ nghiên cứu: https://www.degruyter.com/document/doi/10.2478/s11696-013-0428-3/html
| CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI – DỊCH VỤ – KỸ THUẬT VIỆT NGUYỄN | |
| Địa chỉ | VPHCM: số N36, đường số 11, P. Tân Thới Nhất, Q.12, Tp. Hồ Chí Minh
VPĐN: Số 10 Lỗ Giáng 5, phường Hòa Xuân, quận Cẩm Lệ, Tp. Đà Nẵng VPHN: 138 Phúc Diễn, P. Xuân Phương, Q. Nam Từ Liêm, Tp. Hà Nội VP Cần Thơ: 275 Xuân Thủy, P. An Bình, Q. Ninh Kiều, Tp. Cần Thơ |
| Hotline | PHÒNG MARKETING – TRUYỀN THÔNG:
|
| info@vietnguyenco.vn | |
| Website | https://www.vietcalib.vn| https://www.vietnguyenco.vn |
