Dấu hiệu việc gian lận thương mại dùng mật gạo trong mật ong giả

Phát hiện hàm lượng vết mức độ tạp nhiễm mật ong ở mức 1% (w/w) bằng cách sử dụng hệ thống SCIEX QTRAP 6500+

1. Giới thiệu tình hình làm mật ong giả

Phương pháp này mô tả một phương pháp đơn giản “Pha loãng và tiêm” để định lượng 2-acetylfuran-3-glucopyranoside (AFGP) như một chỉ báo hóa học để phát hiện mật ong bị làm giả bằng mật gạo. Độ nhạy của hệ thống QTRAP 6500+ đã cho phép phát hiện AFGP với mức giới hạn định lượng (LOQ) là 0,05 mg/kg, thấp hơn mức yêu cầu của Cơ quan An toàn Thực phẩm và Tiêu chuẩn Ấn Độ (FSSAI). Phương pháp này đã định lượng AFGP trong mật ong được tạo giả bằng cách thêm mật nếp chỉ 1% (w/w) và trong các loại mật ong được mua địa phương (Hình 1).

Một cuộc khảo sát gần đây của Cơ quan Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) báo cáo sự làm giả trong 10% số sản phẩm mật ong nhập khẩu, trong khi một cuộc điều tra do Ủy ban Châu Âu tiến hành đã phát hiện ra rằng 46% mẫu mật ong đã được kiểm tra nghi ngờ là bị làm giả bằng các chất làm ngọt giá rẻ như siro đường từ gạo, củ cải và mía đường. Độ chính xác của mật ong được kiểm soát chặt chẽ ở Mỹ và châu Âu, điều này đòi hỏi sự cần thiết của các kỹ thuật phân tích có khả năng phát hiện các chất làm giả từ siro ở mức độ thấp.

Siro gạo bao gồm các oligo và polysaccharides giống như mật ong. Do đó, việc phát hiện làm giả mật ong là khó khăn. Các kỹ thuật phổ thông, như phân tích tỷ lệ izotop cacbon ổn định (SCIRA) và sắc ký trao đổi anion hiệu suất cao kết hợp với phát hiện pulsed amperometric (HPAEC-PAD), thiếu độ đặc hiệu để phân biệt siro gạo và mật ong và thường đòi hỏi quá trình chuẩn bị mẫu làm phiền phức. Các phương pháp dựa trên LC-MS/MS đã kiểm soát hàm lượng AFGP như một chỉ báo riêng biệt cho sự làm giả mật ong bằng siro gạo. FSSAI quy định rằng AFGP phải không xuất hiện trong các sản phẩm mật ong. Ở đây, một phương pháp đáp ứng mức hiệu suất tối thiểu yêu cầu (MRPL) của FSSAI là 1 mg/kg để phát hiện AFGP như một chỉ báo của siro gạo trong mật ong được mô tả.

Các đặc điểm chính của kiểm tra tính xác thực của mật ong:

– Độ nhạy của hệ thống QTRAP 6500+ đã cho phép phương pháp “Pha loãng và tiêm” đơn giản để định lượng AFGP ở LOQ là 0,05 mg/kg, thấp hơn yêu cầu của FSSAI.

– Các điều kiện sắc ký được tối ưu hóa để đạt được sự phân tách của AFGP khỏi các đường đường chính trong mật ong.

– Tỷ lệ ion chấp nhận được (±20%), độ chính xác (70–130%) và giá trị chính xác (%CV <15%, n = 6) được đạt trong các mẫu kiểm soát chất lượng được chuẩn bị trong mật ong và mật ong được tạo giả trong phòng thí nghiệm.

– Việc áp dụng phương pháp đã phát hiện AFGP trong mật ong bị làm giả với chỉ 1% (w/w) siro gạo.

2. Phương pháp phân tích mật ong giả do pha trộn siro gạo

– Hóa chất và mẫu: Một chuẩn AFGP nguyên chất đã được sử dụng để chuẩn bị dung dịch chuẩn trong methanol. Từ các dung dịch chuẩn, các tiêu chuẩn hiệu chuẩn (0,5–25 ng/mL) đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng dung dịch đệm Amoni Formate 2mM như chất pha loãng.

– Tám mẫu mật ong (nhãn hiệu A-H) và 1 mẫu siro gạo nâu đã được mua địa phương và đã được kiểm tra trước đó cho AFGP. Một nhãn hiệu mật ong không chứa AFGP đã được chọn để chuẩn bị các mẫu kiểm soát chất lượng.

– Hiệu suất thu hồi quy trình trong nền mẫu mật ong Spike: Nền mẫu kiểm soát chất lượng đã được chuẩn bị ba lần bằng cách spike mật ong không chứa AFGP ở 2 mức nồng độ khác nhau (0,5 mg/kg và 2,5 mg/kg) trước và sau quy trình chuẩn bị mẫu. Đối với các mẫu kiểm soát trước khi spike, AFGP đã được spike trực tiếp vào một lượng nhỏ mật ong và sau đó được đưa qua quy trình chuẩn bị mẫu.

Đối với các mẫu kiểm soát sau khi spike, việc spike đã xảy ra trong chiết xuất cuối cùng. Việc hiệu suất thu hồi được tính như là tỉ số của diện tích đỉnh trong các mẫu kiểm soát trước và sau khi spike. Hiệu suất thu hồi cũng đã được đánh giá bằng cách spike AFGP ở 1 mg/kg và 2,5 mg/kg trong mật ong được pha loãng với 10% (w/w) siro gạo để đánh giá hiệu suất chuẩn bị mẫu trong một nền mẫu mật ong được làm giả trong phòng thí nghiệm.

– Làm giả mật ong bằng siro gạo: Siro gạo đã được pha loãng với mật ong ở các tỷ lệ từ 1% đến 30% (w/w) để mô phỏng sự làm giả. Tóm lại, siro gạo đã được cân trong một chai thủy tinh 15 mL mà sau đó mật ong đã được thêm vào dựa trên các tỷ lệ đã nêu ở trên. Để giảm độ nhớt, hỗn hợp đã được pha loãng đã được ủ ở nhiệt độ 60–70°C trong 5–10 phút cho đến khi độ nhớt của mẫu đạt đến trạng thái đồng nhất và dễ dàng chảy ra tự do.

– Chuẩn bị mẫu: Quy trình chuẩn bị mẫu là giống nhau cho tất cả các loại mẫu (mẫu kiểm soát nền mẫu, các nhãn hiệu mật ong khác nhau, mật ong bị làm giả trong phòng thí nghiệm và siro gạo). Tóm lại, một mẫu 500 mg đã được kết hợp với 20 mL dung dịch nước amoni formate 2mM trong nước trong một ống 50 mL và lắc đều cho đến khi hoàn toàn tan. Thể tích cuối cùng đã được điều chỉnh thành 50 mL với dung dịch nước amoni formate 2mM trong nước, lắc đều, lắc đều trong vòng 30 giây và sau đó được lọc qua bộ lọc bơm tiêm PVDF 0,22 μm. Một lượng nhỏ của chất lọc mẫu đã được chuyển sang chai tự động hóa cho phân tích LC-MS/MS mà không cần phải pha loãng thêm.

– Sắc ký: Sự phân tách LC đã được thực hiện trên hệ thống ExionLC AD sử dụng một cột Phenomenex Gemini-NX C18 (3 μm, 100 Å, 100 x 3 mm, P/N: 00D-4453-Y0). Một tỷ lệ dòng chảy là 0,35 mL/phút, một thể tích phun 5 μL và một nhiệt độ cột 35°C đã được sử dụng. Bảng động được trình bày trong Bảng 1.

– Khối phổ: Phân tích đã được thực hiện bằng hệ thống QTRAP 6500+ với một nguồn ion IonDrive Turbo V ở chế độ ion hóa tích cực. Một dung dịch của AFGP đã được tiêm vào máy phổ để tối ưu hóa các thông số của nguồn, khí và các tham số phụ thuộc vào hợp chất, như được thể hiện trong Bảng 2.

Tối ưu điều kiện sắc ký cho AFGP

Các điều kiện sắc ký đã được tối ưu một cách kỹ lưỡng để phân tách AFGP khỏi các đường chính cùng chiết xuất có mặt trong mật ong bằng cách kiểm tra các cột LC khác nhau, các pha động và các biểu đồ. Các bộ đệm khác nhau và các dung môi hữu cơ đã được kiểm tra để lựa chọn pha động. Hình 2 cho thấy sự phân tách của AFGP khỏi nền tương ứng sử dụng các điều kiện tối ưu cuối cùng, như đã mô tả trước đó.

Độ tuyến tính và độ nhạy

Hiệu suất tuyến tính chấp nhận được đã được đạt được cho đường chuẩn dựa trên dung môi trong khoảng từ 0,5 đến 25 ng/mL được chuẩn bị trong dung dịch nước Amoni Formate 2mM (Bảng 3).

LOQ trong Vial của AFGP được xác định là 0,5 ng/mL dựa trên mức chuẩn thấp nhất đạt được độ chính xác trung bình là ±15%, %CV <15% và tỷ lệ ion trong khoảng ±30%. Hình 3 thể hiện các ví dụ XIC của chất chuẩn hiệu chuẩn LOQ ở mức 0,5 ng/mL được tiêm ba lần trong suốt batch.

Hiệu suất phương pháp trong các mẫu QC spike trên nền mẫu

Một nền mẫu mật ong trắng và mật ong pha loãng với 10% (w/w) siro gạo đã được spike bằng AFGP trước và sau quá trình chuẩn bị mẫu để đánh giá các sự thu hồi trong các nồng độ gần với MRPL của FSSAI là 1 mg/kg. Các sự hiệu suất thu hồi của nền mẫu chấp nhận được là 102–110% với %CV là 2–6% cho 6 bản sao tại mỗi mức spike dựa trên tỉ số của diện tích đỉnh trong các mẫu trước và sau khi spike (Bảng 4). Tính toán này đã được thực hiện trực tiếp trong bảng kết quả bằng tính năng cột đã tính toán trong phần mềm SCIEX OS, như được thể hiện trong Hình 4.

Việc sử dụng chuẩn chuẩn dựa trên dung môi cũng được coi là phù hợp ở đây dựa trên sự ức chế nền mẫu thấp (<20%) được tính từ tỉ số của diện tích đỉnh trong các mẫu sau khi spike của nền mẫu mật ong trắng và tiêu chuẩn được chuẩn bị ở các nồng độ tương tự. Sự ức chế cao hơn đã được quan sát cho các mẫu mật ong được làm giả trong phòng thí nghiệm có thể do AFGP nền và các tác động ngoài nền mẫu bổ sung từ nền mẫu siro gạo, có thể được giải quyết bằng cách sử dụng một chuẩn nội bộ được đánh dấu hoặc phù hợp để bù đắp cho các hiệu ứng nền mẫu.

Độ tái lặp của phương pháp

Sự tái lặp của phương pháp đã được đánh giá bằng một lô thu thập bao gồm >300 lần tiêm tương ứng với >35 giờ thời gian chạy. Các biểu đồ số liệu được tạo ra bởi phần mềm SCIEX OS chỉ ra rằng tỷ lệ ion đã nhất quán và thời gian lưu đã nằm trong ±30% so với giá trị trung bình trong toàn bộ lô (Hình 5). Tiêu chuẩn LOQ được tiêm vào đầu và cuối lô đã thể hiện phản ứng diện tích đỉnh tương tự sau khi tiêm vào 300 mẫu có độ phức tạp khác nhau, như các mẫu trắng dung môi, mật ong và mật ong được làm giả pha loãng bằng siro gạo. Kết quả này làm nổi bật hiệu suất bền bỉ của phương pháp trong một khoảng thời gian dài, ngay cả khi phân tích các nền mẫu mật ong phức tạp.

Phân tích của mật ong bị làm giả

Các cuộc điều tra trước đây về tính xác thực của mật ong thường sử dụng một phạm vi spike từ 10–50% (w/w) siro gạo để mô phỏng mật ong bị làm giả. Tại đây, sự làm giả đã được đánh giá bằng cách pha loãng mật ong với siro gạo ở mức độ từ 1% đến 30% (w/w) (Hình 6), với mục tiêu mô phỏng các thực hành gian lận thực tế của các nhà sản xuất mật ong. Phản ứng của AFGP đã thể hiện một sự tăng tuyến tính (r = 0,996) với mức độ làm giả. Các nồng độ của AFGP dao động từ 0,14 mg/kg đến 3,2 mg/kg. Phương pháp dễ dàng định lượng AFGP ở tỷ lệ pha trộn thấp nhất là 1% (w/w) với tỷ lệ ion ổn định (±20%) và S/N ≥20 cho cả hai dấu chuyển xác định và xác định. Điều này cho thấy phương pháp dilute-and-shoot hiện tại cung cấp độ nhạy đủ để định lượng AFGP dưới mức độ thường được sử dụng để làm giả (≥10%).

Phân tích của mật ong bán lẻ

Dựa trên hiệu suất thu hồi nền mẫu và các hiệu ứng nền mẫu được chấp nhận đã được thảo luận trước đó, LOQ trong Vial được chọn từ tiêu chuẩn calib trong dung môi thấp nhất là 0,5 ng/mL đã được sử dụng để xác định LOQ dựa trên khối lượng trong mật ong. Bằng cách tính toán ngược lại qua quá trình chuẩn bị mẫu để tính đến thể tích pha loãng và khối lượng mật ong chiết xuất ban đầu, LOQ dựa trên khối lượng đã được xác định là 0,05 mg/kg, thấp hơn MRPL của FSSAI là 1 mg/kg. Cùng tính toán đã được áp dụng để chuyển đổi các nồng độ AFGP trong các chiết xuất sang các mẫu bán lẻ gốc.

Phương pháp đã được áp dụng để sàng lọc sự hiện diện của AFGP trong một mẫu siro gạo nâu và 8 nhãn hiệu mật ong được mua địa phương. Bảng 5 tóm tắt các nồng độ AFGP và độ chính xác dựa trên các bản sao tiêm của các mẫu phân tích. Ngoại trừ một số mẫu trắng, tất cả các mẫu đều có chứa AFGP trong một phạm vi từ 0,14 đến 2,9 mg/kg. Mật ong từ nhãn hiệu G và H đã được phát hiện có chứa AFGP với mật độ nồng độ tương ứng 0,9 và 0,7 mg/kg. Hiệu suất thu hồi cho tất cả các mẫu ngoại trừ một mẫu trắng là trong khoảng từ 80% đến 110%, với CV từ 1,9% đến 5,7%.

3. Tổng kết

• Độ nhạy của hệ thống QTRAP 6500+ đã cho phép một phương pháp LC-MS/MS pha loãng và tiêm mạnh mẽ để phân tích AFGP như một chỉ báo siro gạo để kiểm tra tính xác thực của mật ong.

• Hiệu suất phương pháp chấp nhận được đã được đạt được với tính tuyến tính của việc hiệu chuẩn là r >0.99, độ chính xác trong phạm vi ±30%, độ chính xác %CV <15% và tỉ lệ ion trong phạm vi ±30%

• Việc sử dụng hiệu chuẩn dựa trên dung môi đã tạo ra sự phục hồi chấp nhận được trong các mẫu kiểm soát ma trận (102–110%) và ức chế ma trận (<20%) trong các mẫu mật ong trắng, tuy nhiên việc sử dụng các tiêu chuẩn nội bộ được khuyến nghị mạnh mẽ để chống lại các hiệu ứng ma trận trong các ma trận phức tạp hơn, chẳng hạn như mật ong bị làm giả.

• Các phép tính có thể được thực hiện trực tiếp trong phần mềm SCIEX OS mà không cần phải xuất dữ liệu nơi khác.

• Phương pháp hiện tại đã đạt được LOQ là 0,05 mg/kg, thấp hơn 20 lần so với MRPL của FSSAI là 1 mg/kg cho việc phân tích AFGP như một chỉ báo cho việc làm giả mật ong bằng siro gạo.

4. Tài liệu tham khảo

U.S. Food and Drug Administration. FY21/22 Sample Collection and Analysis of Imported Honey for Economically Motivated Adulteration. (2022) https://www.fda.gov/food/economically-motivated- adulteration-food-fraud/fy2122-sample-collection-and- analysis-imported-honey-economically-motivated- adulteration
European Commission. EU coordinated action “From the Hives” (Honey 2021-2022). (2023) https://food.ec.europa.eu/safety/eu-agri-food-fraud- network/eu-coordinated-actions/honey-2021-2022_en
Xue, X.; Wang, Q.; Li, Y.; Wu, L.; Chen, L.; Zhao, J.; Liu, F. (2013) 2-Acetylfutran-3-Glucopyranoside as a Novel Marker for the Detection of Honey Adulterated with Rice Syrup. J. Agric. Food Chem. 61, 7488-7493.
Du, B.; Wu, L.; Xue, X.; Chen, L.; Li, Y.; Zhao, J.; Cao, W. (2015) Rapid Screening of Multiclass Syrup Adulterants in Honey by Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography/Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 63, 6614-6623.
Akyildiz, İ; Uzunöner, D.; Raday, S.; Acar, S.; Erdem, Ö; Damarli, E. (2022) Identification of the rice syrup adulterated honey by introducing a candidate marker compound for Brown rice syrups. LWT Food Sci Technol. 154, 112618.
Food Safety and Standards Authority of India. Method for detection of 2-acetylfuran-3-glucopyranoside (2-AFGP)/3-O- α-D-glucosyl isomaltol, the specific marker for rice syrup (SMR) by LC-MS/MS – reg. (2020) https://www.fssai.gov.in/upload/advisories/2020/06/5ed8cc3 cb0336Order_SMR_Method_Honey_04_06_2020.pdf

Mời Quý khách hàng tham khảo thêm các sản phẩm tại: https://vietnguyenco.vn/

Quý khách có nhu cầu tư vấn, vui lòng liên hệ:

CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI – DỊCH VỤ – KỸ THUẬT VIỆT NGUYỄN
Địa chỉ	VPHCM: số N36, đường số 11, P. Tân Thới Nhất, Q.12, Tp. Hồ Chí Minh VPĐN: Số 10 Lỗ Giáng 5, phường Hòa Xuân, quận Cẩm Lệ, Tp. Đà Nẵng VPHN: 138 Phúc Diễn, P. Xuân Phương, Q. Nam Từ Liêm, Tp. Hà Nội
Hotline	PHÒNG TƯ VẤN ỨNG DỤNG: 0962 977 834 (Ms. Phượng) – Email: phuong.lt@vietnguyenco.vn
Email	info@vietnguyenco.vn
Website	https://www.vietcalib.vn\| https://www.vietnguyenco.vn