Xác định và định lượng 57 chất PFAS ở mức ng/kg trong thực phẩm bằng LC-MS/MS

Nối tiếp các nghiên cứu và phân tích PFAS ở các bài viết trước về các ứng dụng của LC-MS/MS trong lĩnh vực khoa học và phân tích. Ở các bài viết trước Việt Nguyễn đã giới thiệu và phân tích về PFAS, link tham khảo bài viết: https://vietnguyenco.vn/ung-dung-cong-nghe-lc-ms-ms-cua-sciex-trong-phan-tich-pfas/ và https://vietnguyenco.vn/phan-tich-pfas-bang-he-thong-sciex-triple-quad-qtrap-va-qtof/ .Trong bài viết này, chúng tôi sẽ giới thiệu về các giải pháp phân tích PFAS (per- và polyfluoroalkyl) sử dụng các hệ thống LC-MS/MS của SCIEX để Xác định và định lượng 57 chất PFAS ở mức ng/kg trong thực phẩm bằng.

1. Giới thiệu

Per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) bao gồm một nhóm lớn các hóa chất nhân tạo được sử dụng trong các ứng dụng khác nhau. Theo Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD), PFAS được định nghĩa là các hợp chất có gốc carbon methyl hoặc methylene được flo hóa hoàn toàn. Sự đa dạng về cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý giải thích việc sử dụng chúng trong nhiều ứng dụng, ví dụ như bọt tạo màng nước chữa cháy (AFFFs), trong dụng cụ nấu nướng chống dính, làm chất chống vết bẩn, cũng như trong bao bì thực phẩm và dệt may.

Do liên kết carbon – flo cực kỳ mạnh nên rất khó sự phân hủy trong môi trường dẫn đến tích tụ. Do đó, PFAS xâm nhập vào chuỗi thức ănqua nước và đất cũng như qua thực vật, cá, rau, trứng và thức ăn chăn nuôi gây ô nhiễm sữa và thịt. Các nguồn ô nhiễm thực phẩm có thể khác bao gồm sự di chuyển từ vật liệu đóng gói thực phẩm hoặc thiết bị chế biến.

Kể từ những năm 2000, PFAS đã thu hút được nhiều sự chú ý và cụ thể hơn là perfluorooctane sulfonic acid (PFOS) và perfluorooctanoic acid (PFOA), được coi là các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy (POP) và được liệt kê trong Công ước Stockholm về POP (UNEP). Mặc dù có số lượng lớn PFAS – khoảng 14000 hợp chất được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ trích dẫn (USEPA ) – Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) đã đặt ra vào năm 2020 giới hạn lượng tiêu thụ hàng tuần (TWI) có thể chấp nhận được ở mức 4,4 ng/kg trọng lượng cơ thể chỉ đối với bốn PFAS (PFOS, PFOA, PFNA – axit perfluorononanoic và PFHxS – axit sulfonic perfluorohexan). EFSA cũng liệt kê một số mặt hàng thực phẩm được xếp hạng là nguyên nhân chính gây phơi nhiễm qua chế độ ăn uống của con người, cụ thể là cá, thịt, trứng, trái cây và rau quả. Thực tiễn hiện tại của ngành là ngừng các hợp chất được quản lý và thay thế chúng bằng các chất tương tự về cấu trúc mà hiện không được theo dõi hoặc có trong danh sách được quản lý.

Vào tháng 8 năm 2022, Liên minh Châu Âu (EU) đã ban hành Khuyến nghị EU 2022/1431 đặt ra các giới hạn định lượng (LOQ) đối với PFOS, PFOA, PFNA, PFHxS trong một số chất nền thực phẩm, bao gồm trái cây và rau quả, cá và thịt, trứng, dầu cá , sữa và thức ăn cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ chuẩn bị ăn dặm. LOQ mục tiêu thấp nhất được khuyến nghị cho trái cây, rau củ, thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ nằm trong khoảng từ 0,001 µg/kg đến 0,004 µg/kg tùy thuộc vào hợp chất. Trong Khuyến nghị, phạm vi chất phân tích không có LOQ bắt buộc bao gồm 32 hợp chất bổ sung. Vào tháng 12 năm 2022, Quy định của Ủy ban EU 2022/2388 đã thiết lập các mức tối đa (ML) đối với PFOS, PFOA, PFNA, PFHxS trong thực phẩm trứng, cá và thịt, trong đó ML thấp nhất đối với PFOA và PFHxS được đặt ở mức 0,3 µg/kg đối với trứng và đối với PFOA, PFNA và PFHxS được đặt ở mức 0,2 µg/kg trong thịt cá và thịt (thịt bò, thịt lợn, gia cầm và cừu) dùng để sản xuất thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Mức tối đa áp dụng cho tổng các đồng phân lập thể tuyến tính và phân nhánh, cho dù chúng có được phân tách bằng sắc ký hay không.

Trong bối cảnh này, mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là phát triển và xác nhận một phương pháp xác định đồng thời 57 PFAS trong bảy chất nền khác nhau, cụ thể là thức ăn nhuyễn cho trẻ em (thịt bò), sữa công thức dành cho trẻ sơ sinh (như đã bán), sữa bột nguyên kem , cá, trứng nguyên quả, cà phê hòa tan và dầu cá bằng LC-MS/MS. Phạm vi chất phân tích không chỉ bao gồm các hợp chất có trong Khuyến nghị 2022/1431 mà cả những loại được liệt kê trong phương pháp của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ để phân tích PFAS trong thực phẩm chế biến, cũng như các hợp chất đã được khảo sát bởi một số phòng thí nghiệm dịch vụ ở Châu Âu hoặc đã được đề cập trước đây trong tài liệu.

2. Vật liệu và phương pháp

Hóa chất và thuốc thử

Danh sách chi tiết về PFAS bao gồm 57 chất phân tích gốc được nhắm mục tiêu và 33 chất chuẩn nội được dán nhãn đồng vị có sẵn.

Mẫu

Các mẫu được chia thành hai nhóm: Nhóm A bao gồm các mặt hàng thực phẩm được sử dụng trong dinh dưỡng trẻ sơ sinh mà quá trình phân tích yêu cầu bước cô đặc trước khi phân tích LC-MS/MS để đạt LOQs thấp nhất có thể và Nhóm B bao gồm các chất nền thực phẩm, chủ yếu là những loại được liệt kê trong Quy định của Ủy ban EU 2022/2388 (Hình 1)

Chuẩn bị mẫu

Nguyên tắc chung của phương pháp được đưa ra trong Hình 1. Trước khi lấy mẫu phụ để phân tích, các mẫu bột (sữa công thức dành cho trẻ sơ sinh, nguyên liệu làm từ sữa, ngũ cốc, cá/sản phẩm thịt, cà phê và trứng) và dầu lỏng được đồng nhất trực tiếp bằng cách trộn vào vật chứa ban đầu. Thức ăn trẻ em đựng trong lọ, cá tươi và cả quả trứng được xay nhỏ bằng máy xay gia dụng, đề phòng tránh nhiễm chéo bằng cách rửa tất cả nguyên liệu bằng metanol loại ULC-MS trước khi sử dụng. Cuối cùng, chất béo và dầu ở thể rắn ở nhiệt độ phòng được nấu chảy ở 50°C trong nồi cách thủy và sau đó được trộn trực tiếp vào vật chứa ban đầu của chúng.

Thực phẩm đồng nhất (2,00 ± 0,05 g đối với chất nền Nhóm A hoặc 1,00 ± 0,02 g đối với chất nền Nhóm B) được thêm vào ống ly tâm polypropylen 50 mL và thêm hỗn hợp các chất chuẩn đồng vị được đánh dấu (các dung dịch chất chuẩn làm việc hỗn hợp được đánh dấu, ở nồng độ 1 & 2 ), sau đó được trộn kỹ để đảm bảo rằng thể tích tăng vọt được nhóm các chất phức tạp có thể gây nhiễu cho kết quả phân tích hấp thụ hoàn toàn.

3. Kết quả

Background contamination

Một số nguồn PFAS trong phòng thí nghiệm có thể góp phần tạo ra kết quả tích cực khi phân tích các mẫu ở nồng độ thấp, ví dụ như nắp, dung môi, hộp SPE, các thành phần ống hoặc từ các thành phần flo hóa có trong môi trường phòng thí nghiệm. Để giảm nhiễu nền này càng nhiều càng tốt, việc sử dụng vật liệu polypropylene được ưu tiên cho cả việc chuẩn bị mẫu (ống định mức, cốc, ống, v.v.) và phân tích (lọ và nắp). Ngoài ra, các dung môi cấp ULC-MS được sử dụng một cách có hệ thống trong toàn bộ quá trình do độ tinh khiết cao của chúng. Tất cả các lớp lót polytetrafluoroethylene (PTFE) của thiết bị SPE đã được thay thế bằng lớp lót bằng thép không gỉ. Đối với các pha động LC, các nắp polypropylen được lắp trên đỉnh chai và sử dụng các ống dẫn khí bằng thép không gỉ. Hơn thế nữa, các thành phần ống polypropylene cũng đã thay thế ống PTFE hiện có cho các pha động. Trước khi tiêm LC-MS/MS, các dung dịch chiết xuất cuối cùng được ly tâm (ở mức 13000 g) thay vì được lọc để tránh mọi khả năng nhiễm bẩn bắt nguồn từ các bộ lọc hoặc bất kỳ sự hấp phụ nào trên vật liệu lọc. Ngoài ra, một cột trì hoãn đã được lắp đặt giữa máy bơm và vòi phun bên ngoài lò sấy cột để trì hoãn việc lưu giữ bất kỳ PFAS nào đến từ pha động hoặc bột chiên. Ô nhiễm nền được theo dõi hàng ngàythông qua phân tích thuốc thử trắng. Bất chấp tất cả các biện pháp phòng ngừa này, ba hợp chất, PFOA, L-PFOS và PFHxDA, luôn có mặt trong dịch chiết thuốc thử trắng với độ biến thiên 20% cho mỗi chất. Đối với PFOA, lượng dư 0,010 ng/mL đã được phát hiện, tương ứng với nồng độ tương đương ở mức 0,005 µg/kg đối với chất nền Nhóm A và 0,080 µg/kg đối với chất nền Nhóm B. Đối với L-PFOS, có một lượng 0,007 ng/mL, tương ứng với nồng độ tương đương 0,004 µg/kg và 0,056 µg/kg đối với chất nền Nhóm A và B, tương ứng. Đối với PFHxDA, mức này là 0,050 ng/mL, nồng độ tương đương ở mức 0,025 µg/kg và 0,400 µg/kg đối với chất nền Nhóm A và B, tương ứng.

Theo Khuyến nghị EU 2022/1431, LOQ mục tiêu được yêu cầu trong thực phẩm dành cho trẻ sơ sinh đối với PFOA là 0,001 µg/kg và đối với PFOS là 0,002 µg/kg, trong mẫu cá và thịt đối với cả PFOA và PFOS là 0,100 µg/kg, trong mẫu trứng đối với cả PFOA và PFOS ở mức 0,300 µg/kg và trong dầu cá ở mức 0,500 µg/kg đối với cả hai hợp chất. Xem xét điều này, không thể đạt được các LOQ mục tiêu được yêu cầu đối với PFOA và L-PFOS trong thực phẩm dành cho trẻ sơ sinh do mức nhiễm nền cao hơn gấp 5 và 2 lần trong mẫu trắng thuốc thử đối với PFOA và L-PFOS tương ứng. Theo tài liệu hướng dẫn EURL POPs, sự đóng góp của nồng độ thuốc thử trắng phải ≤30% các mức trong mẫu được phân tích trong cùng một đợt phân tích. Trong trường hợp PFOA, sự đóng góp của nồng độ thuốc thử trắng vào mức LOQ tăng vọt trong thịt bò xay nhuyễn là 31%, vượt quá giới hạn 30% một chút. Đối với PFHxDA, mức đóng góp là 41% cho cùng một chất nền và cấp độ. Việc trừ nồng độ thuốc thử trắng khỏi nồng độ mẫu tăng cường là điều cần thiết để báo cáo dữ liệu đáng tin cậy và do đó, mức LOQ đối với PFHxDA phải tăng từ 0,050 lên 0,070 µg/kg.

Tối ưu hóa phương pháp

PFAS được nhắm mục tiêu có các hằng số phân ly axit khác nhau ( pKa ), yêu cầu kiểm soát tốt độ pH trong pha động để đảm bảo thời gian lưu ổn định của từng hợp chất và đạt được sự phân tách sắc ký đầy đủ. Độ dốc UHPLC được chọn cho phép tách 57 PFAS bằng cột C18. Do bao gồm một số PFAS có đặc tính di-anion (8:2 PAP, 8:2 diPAP và capstones) trong phạm vi chất phân tích, độ pH cao trong pha động thực sự cần thiết để tăng cường độ ion của chúng và cho phép cả hai – Các chất phân tích tích điện và tích điện kép được rửa giải cùng một lúc. Do đó, độ pH của pha động trong nước được đặt ở mức 10,4, dẫn đến độ phân giải cực đại và đáp ứng tín hiệu phù hợp. Hỗn hợp MeOH và ACN (1:1, v/v) được chọn làm pha động hữu cơ như đã thực hiện trước đây nhưng với việc bổ sung 1-methylpiperidin để cải thiện hình dạng pic và cường độ ion.

Chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng chiết xuất rắn-lỏng bao gồm hỗn hợp ACN và nước, sau đó là quá trình làm sạch SPE trao đổi anion yếu/than chì hóa than chì như đã được trích dẫn trong một số nghiên cứu. Tuy nhiên, để phân tích capstone A và capstone B trong matrix Nhóm A, phương pháp pha loãng và bắn phải được xem xét vì các hợp chất zwitterion này không được giữ lại một cách hiệu quả trên cột SPE.

Để định lượng đáng tin cậy bằng phép đo khối phổ, việc sử dụng các chất đồng vị được đánh dấu làm chất chuẩn nội được công nhận là cách vàng để bù cho cả sự mất mát của các hợp chất trong quá trình chiết mẫu và các hiệu ứng nền được tạo ra trong quá trình ion hóa. Đối với các hợp chất không có chất đồng vị được đánh dấu có bán trên thị trường, việc định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng chất chuẩn nội có cấu trúc giống nhất.

Hiệu suất phương pháp

4. Thảo luận

Trong những năm qua, một số phương pháp dành riêng cho việc xác định định lượng PFAS trong thực phẩm đã được công bố trong tài liệu, hầu hết các phương pháp này dựa trên LC-MS/MS ngay cả khi phép đo sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao (LC-HRMS) xuất hiện như một phương pháp hấp dẫn.

Liên quan đến hiệu suất của các phương pháp đã xuất bản, một số khác biệt dễ thấy trong LOQ xuất hiện giữa các phương pháp đó ( Hình 5). Các chiến lược khác nhau trong việc chuẩn bị mẫu kết hợp với các thiết bị và phương pháp phân tách sắc ký khác nhau có thể giải thích sự đa dạng trong LOQ. Tuy nhiên, chúng tôi muốn thu hút sự chú ý đến thực tế là định nghĩa được áp dụng cho LOQ có thể ảnh hưởng hơn nữa đến hiệu suất rõ ràng của phương pháp. Đặc biệt, khi LOQ được tuyên bố chỉ dựa trên một tiêu chí áp dụng cho tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm, mà không có sự kiểm soát và xác thực sau đó bằng cách tăng đột biến trong matrix, thì nguy cơ dẫn đến kết quả sai hoặc gây nhầm lẫn là rất lớn, đặc biệt là ở mức độ thấp. Một số cản trở đã được báo cáo và phải hết sức cẩn trọng đối với sự nhiễm bẩn trong phòng thí nghiệm; điều này có thể làm gián đoạn khả năng phát hiện của phương pháp nếu nó không được đánh giá đúng cách. Đáng chú ý, khái niệm giới hạn xác nhận đã được áp dụng bởi Berendsen et al. để ngăn ngừa nguy cơ phát hiện sai. Một nghiên cứu liên phòng thí nghiệm gần đây đã chỉ ra mức độ khó khăn khi phân tích PFAS bằng LC-MS/MS , trong những trường hợp như vậy, chúng tôi đã áp dụng các tiêu chí nhận dạng của Châu Âu và xác nhận LOQ bằng cách bổ sung vi chất trong matrix thực phẩm trước khi phân tích, sau đó là đánh giá độ đúng và độ chính xác, để đảm bảo kết quả đáng tin cậy nhất có thể với công nghệ hiện có.

5. Kết luận

Nghiên cứu hiện tại mô tả một phương pháp phân tích để xác định 57 PFAS trong các mặt hàng thực phẩm khác nhau để đảm bảo tuân thủ Quy định gần đây của EU và Khuyến nghị của EU  mà còn cho mục đích điều tra. Một số vấn đề đã gặp phải trong quá trình phát triển phân tích này:

a) bảy hợp chất trong số năm mươi bảy hợp chất không thể đáp ứng các tiêu chí xác nhận do EURL POP đặt ra vì chỉ có sẵn một phản ứng chuyển tiếp MS;

b) hợp chất zwitterion capstone A và capstone B, được liệt kê là chất phân tích mới nổi trong EU 2022/1431  chỉ được xác nhận đối với thực phẩm dành cho trẻ em và các sản phẩm từ sữa, do đó cần có nhiều công việc hơn để đưa chúng vào giám sát các loại thực phẩm khác;

c) vì nhiều PFAS được dán nhãn đồng vị chưa có sẵn trên thị trường, hiệu suất của phương pháp đối với các loài không được dán nhãn liên quan bị ảnh hưởng;

d) ô nhiễm nền hệ thống là một yếu tố hạn chế để đạt được LOQ theo yêu cầu của EU đối với một số mặt hàng, thường yêu cầu báo cáo ở cấp độ cao hơn để đáp ứng các yêu cầu về EURL POPs

Nhìn chung, dữ liệu xác thực của chúng tôi đã chứng minh tính mạnh mẽ của phương pháp đối với hầu hết các hợp chất và LOQ đạt được đủ thấp để đảm bảo việc thu thập dữ liệu xảy ra trong tương lai ở mức ng/kg trong một số nền thực phẩm.

Xem chi tiết nghiên cứu tại: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19440049.2023.2226771

Việt Nguyễn là đại diện chính thức của Hãng SCIEX tại Việt Nam

Tham khảo link sản phẩm của của SCIEX tại đây: https://vietnguyenco.vn/thuong-hieu/sciex-my/

Tham khảo link sản phẩm của công ty Việt Nguyễn độc quyền và đại diện phân phối tại đây:  https://vietnguyenco.vn/

Quý khách có nhu cầu tư vấn, vui lòng liên hệ:

CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI – DỊCH VỤ – KỸ THUẬT  VIỆT NGUYỄN
Địa chỉ	VPHCM: số N36, đường số 11, P. Tân Thới Nhất,  Q.12, Tp. Hồ Chí Minh VPĐN: Số 10 Lỗ Giáng 5, phường Hòa Xuân, quận Cẩm Lệ, Tp. Đà Nẵng VPHN: Tầng 1, toà nhà INTRACOM, 33 Cầu Diễn, P. Phúc Diễn, Q. Bắc Từ Liêm, Tp.Hà Nội VP Cần Thơ: 275 Xuân Thủy, P. An Bình, Q. Ninh Kiều, Tp. Cần Thơ
Hotline	PHÒNG MARKETING – TRUYỀN THÔNG: 0932 66 44 22 (Mr. Long) – E: long@vietnguyenco.vn 0842 66 44 22 (Ms. Trúc) – E: truc@vietnguyenco.vn
Email	info@vietnguyenco.vn
Website	https://www.vietcalib.vn| https://www.vietnguyenco.vn