1. Giới thiệu
Độc tố nấm mốc là các chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi nhiều loại nấm được biết là gây ô nhiễm nhiều loại thực phẩm và nông sản trên toàn thế giới và đã được công nhận là mối đe dọa sức khỏe tiềm ẩn đối với con người và động vật. Nhiều quốc gia có các quy định về phát hiện và xác định độc tố nấm mốc cũng như giới hạn cho phép của chúng. Ở Trung Quốc, giới hạn độc tố nấm mốc trong một số sản phẩm nhất định được quy định bởi GB 2761 và ở EU, giới hạn độc tố nấm mốc đượcghi nhận trong quy định về chất gây ô nhiễm trong thực phẩm EC 1881/2006 và quy định sửa đổi EC 1126/2007. Các quy định về phân tích môi trường và thực phẩm yêu cầu phân tích các chất gây ô nhiễm bằng các kỹ thuật xác nhận. Vì vậy, đòi hỏi có một giải pháp phân tích mạnh mẽ và nhanh chóng các phương pháp phân tích có thể phát hiện nồng độ độc tố nấm mốc ở giới hạn phát hiện rất thấp trong nhiều nền mẫu khác nhau.
Trong những năm gần đây, LC MS/MS đã trở nên phổ biến và trở thành phương pháp được lựa chọn, tận dụng khả năng phân tích nhiều loại hợp chất hơn trong một lần phân tích cùng với tính chọn lọc và độ nhạy cao của Giám sát Đa phản ứng ( Multiple Reaction Monitoring – MRM).
Theo các phương pháp kiểm nghiệm truyền thống, các loại độc tố nấm mốc khác nhau yêu cầu các kỹ thuật về chuẩn bị mẫu khác nhau, khiến quá trình này tốn nhiều công sức và thời gian. Trong nghiên cứu ở đây là một quy trình công việc duy nhất để phân tích đồng thời 26 hợp chất. Quy trình này bao gồm một quy trình trích xuất được đơn giản hóa, loại bỏ các bước làm sạch bổ sung bằng cột ái lực miễn dịch và kết hợp nó với quá trình phân tách LC có độ phân giải cao và phát hiện MS có độ nhạy cao.
Hình 1. Hệ thống LC-MS/MS SCIEX Triple Quad™ 3500 MS
2. Các thuộc tính và phương pháp
- Giải pháp LC-MS/MS tích hợp đầy đủ được trình bày để phân tích đồng thời 26 dư lượng độc tố nấm mốc phổ biến trong các mẫu ngũ cốc có liên quan. Chuyển đổi phân cực đảm bảo phạm vi phủ tốt nhất của các chất phân tích có liên quan.
- Quy trình chiết đơn giản hóa được mô tả giúp loại bỏ các bước làm sạch bổ sung, tiết kiệm thời gian và nhân công ở giai đoạn đầu của quá trình phân tích.
- Phương pháp này đã được xác thực về hiệu suất bao gồm độ nhạy và độ bền trong các chất nền hạt khác nhau.
- Giới hạn Định lượng (LOQ) của tất cả độc tố nấm mốc được tìm thấy trong khoảng từ 0,5 µg/kg đến 20 µg/kg. Tất cả LOQ đều đáp ứng các yêu cầu của tiêu chuẩn ngành ngũ cốc.
Hình 2. Giá trị Độ chính xác và LOQ được hiển thị cho Bảng độc tố nấm mốc. Giới hạn Định lượng (LOQ) của tất cả độc tố nấm mốc được tìm thấy trong khoảng từ 0,5 ng/g đến 20ng/g. Độ chính xác được đánh giá qua ba nồng độ dao động từ 80% đến 120%. Các phép đo hiệu suất này chứng minh độ nhạy và độ chính xác tuyệt vời cho xét nghiệm này.
3. Thực nghiệm
Chuẩn bị mẫu: Việc chuẩn bị mẫu được thực hiện theo SOP vMethod (P/N 5060674). Trước tiên, các mẫu ngũ cốc (ngô, gạo, lúa mì, v.v.) được đồng nhất hóa và 2,5 g mẫu được chiết xuất bằng hỗn hợp acetonitril và nước. Sau khi được siêu âm và ly tâm, phần nổi phía trên được đưa qua Cleanert® MC SPE Cartridge (Agela Technologies, P/N ZS-MYT10-B) chứa hóa chất hấp phụ được tối ưu hóa đặc biệt cho độc tố nấm mốc. Dịch lọc sau đó được làm khô và hoàn nguyên để phân tích LC-MS.
Điều kiện LC: Phân tích sắc ký lỏng được thực hiện bằng hệ thống SCIEX ExionLCTM AD UHPLC. 20μL được bơm vào cột Phenomenex Kinetex C18 (100mm X 2,1 mm, 1,7μm, P/N 00D-4475-AN). Pha động A chứa nước với 0,1% acid formic và pha động B chứa metanol với 0,1%.
Bảng 1. Chương trình Thời gian Chuyển màu LC. Tốc độ dòng chảy ở tất
cả các bước là 0,3 mL/phút và tổng thời gian chạy là 13 phút bao gồm cả
cân bằng lại.
Điều kiện MS/MS: Quá trình ion hóa phun điện được thực hiện trên hệ thống SCIEX Triple QuadTM 3500 với chuyển đổi phân cực nhanh. Nguồn Turbo V™ được giữ ở nhiệt độ 550°C và thuật toán MRM™ đã lên lịch được sử dụng để phân tích các mẫu ngũ cốc để tìm 26 độc tố nấm mốc trong một lần tiêm bằng cách ghép kênh phát hiện
nhiều chuyển đổi MRM cho các đoạn signature fragments.
Hình 3. Sắc ký đồ cho 26 Mycotoxin. Cả hai chế độ dương tính và âm tính đều được phân tích đồng thời trong một lần tiêm mẫu, cho phép phân tích tất cả 26 loại độc tố nấm mốc trong một phương pháp thu thập dữ liệu. (Trên cùng) 18 độc tố nấm mốc được thu thập ở chế độ tích cực ESI (trên cùng) và 8 độc tố nấm mốc được thu thập ở chế độ tiêu cực ESI (dưới cùng).
4. Kết quả và thảo luận
Đối với mỗi chất phân tích, hai chuyển đổi MRM đặc trưng đã được chọn để đảm bảo độ tin cậy trong việc xác định từng loại độc tố nấm mốc (Bảng 2). Để theo dõi nhiều chuyển đổi MRM trong một lần tiêm, thuật toán MRM theo chu trình đã được sử dụng, trong đó các chuyển đổi MRM riêng lẻ được theo dõi trong một thời gian ngắn trong thời gian lưu dự kiến của chúng. Do đó, tại bất kỳ thời điểm nào, số lần chuyển đổi MRM đồng thời đã giảm đáng kể dẫn đến chu kỳ nhiệm vụ cao hơn nhiều cho mỗi chất phân tích. Kết hợp với chuyển đổi phân cực nhanh hơn nữa cho phép mở rộng danh sách mục tiêu của độc tố nấm mốc, do đó duy trì thông lượng mẫu bằng cách loại bỏ nhu cầu tiêm nhiều lần. Sắc ký đồ điển hình của dung môi chuẩn được thể hiện trong Hình 3. Tổng thời gian chu kỳ mục tiêu là 0,6 giây đảm bảo thu thập ít nhất 12 điểm dữ liệu trên đỉnh LC dẫn đến độ chính xác và khả năng tái tạo tuyệt vời. Sự phù hợp của hệ thống đã được thử nghiệm với nồng độ chuẩn 5/50 ng/mL và dung dịch chuẩn được tiêm ba lần. %CV của mỗi đỉnh chất phân tích được tính nhỏ hơn 15%.
Để chuẩn bị mẫu, một phương pháp làm sạch mẫu đơn giản đã được phát triển. Thay vì cột ái lực miễn dịch, cột chiết xuất pha rắn (SPE) đặc biệt (Cleanert® MC, Agela) với hóa chất hấp phụ được tối ưu hóa để chiết xuất độc tố nấm mốc đã được sử dụng. Cột này tỏ ra thuận lợi ở chỗ nó không cần kích hoạt, rửa và rửa giải. Nó không chỉ rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu mà còn tiết kiệm chi phí. Hình 4 cho thấy sự so sánh giữa bước làm sạch mẫu trước và sau.
Hình 4. Chuẩn bị và Làm sạch Mẫu. So sánh trực quan mẫu hạt trước và sau bước làm sạch cột Cleanert® SPE. Làm sạch mẫu có thể giúp giảm nhiễu nền cũng như giúp duy trì hiệu suất của thiết bị.
Giới hạn định lượng và độ tuyến tính phù hợp với nền mẫu đã được đánh giá. Do các hiệu ứng ức chế nền, các đường cong phù hợp với nền được sử dụng để định lượng các mẫu chưa biết. Ví dụ, đối với AflatoxinB1 (AFB1) và Deoxynivalenol (DON), phương pháp này được cho là có độ lặp lại tốt và hệ số hồi quy tuyến tính lớn hơn 0,99 (Hình 5). Theo các mức độ nhạy cảm khác nhau của từng hợp chất trên thiết bị, LOQ của tất cả các độc tố nấm mốc được nhắm mục tiêu là từ 0,5 ng/g đến 20 ng/g. Độ chính xác của mẫu thêm chuẩn nồng độ thấp, trung bình và cao là từ 80% đến 120% (Hình 2).
Hình 5. Đường chuẩn cho AflatoxinB1 và Deoxynivalenol. Đường cong hiệu chuẩn được tạo ra từ 5 đến 500 ng/mL. Hai quá trình chuyển đổi MRM đã được theo dõi: đoạn 1 (màu xanh) và đoạn 2 (màu hồng). Các giá trị R được hiển thị cho cả hai quá trình chuyển đổi đối với cả hai chất phân tích đại diện là >0,99, thể hiện phạm vi tuyến tính và phản hồi tuyệt vời cho xét nghiệm.
5. Kết luận
Một phương pháp nhanh, hiệu quả và đáng tin cậy để phát hiện 26 độc tố nấm mốc trong hạt ngũ cốc đã được phát triển và xác nhận. Một phương pháp thanh lọc nhanh đã được sử dụng để bao phủ 26 loại độc tố nấm mốc. LC độ phân giải cao sử dụng cột kích thước hạt nhỏ được kết hợp với khả năng phát hiện độ nhạy cao sử dụng hệ thống SCIEX Triple QuadTM 3500 LC-MS/MS. Giám sát đa phản ứng (MRM) đã được sử dụng vì tính chọn lọc và độ nhạy cao của nó. Thuật toán MRM theo lịch trình được sử dụng để đạt được thời gian dừng và thời gian chu kỳ được tối ưu hóa để có độ nhạy và khả năng tái tạo tốt nhất. Phương pháp này đã được xác nhận ở các loại hạt khác nhau. Giới hạn Định lượng (LOQ) của tất cả độc tố nấm mốc được tìm thấy trong khoảng từ 0,5 µg/kg đến 20 µg/kg. Tất cả LOQ đều đáp ứng các yêu cầu của tiêu chuẩn ngành ngũ cốc.
Bảng 2. Thời gian chuyển đổi và lưu giữ MRM được cung cấp cho hai lần chuyển đổi đối với mỗi độc tố nấm mốc trong Bảng phân tích 26.
Tài liệu tham khảo:
1. GB 2761-2017
2. EC 1881/2006
3. Amended regulation EC 1126/2007
4. Simultaneous Analysis of 14 Mycotoxins and 163 Pesticides in Crude Extracts of Grain by LC/MS/MS, SCIEX Technical note 2110210-01.
5. Jose Diana Di Mavungu, Sofie Monbaliu, Marie-Louise Scippo: Food Additives and Contaminants (2009) 26, 885-895.
| CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI – DỊCH VỤ – KỸ THUẬT VIỆT NGUYỄN | |
| Địa chỉ | VPHCM: số N36, đường số 11, P. Tân Thới Nhất, Q.12, Tp. Hồ Chí Minh
VPĐN: Số 10 Lỗ Giáng 5, phường Hòa Xuân, quận Cẩm Lệ, Tp. Đà Nẵng VPHN: 138 Phúc Diễn, P. Xuân Phương, Q. Nam Từ Liêm, Tp. Hà Nội VP Cần Thơ: 275 Xuân Thủy, P. An Bình, Q. Ninh Kiều, Tp. Cần Thơ |
| Hotline | PHÒNG MARKETING – TRUYỀN THÔNG:
|
| info@vietnguyenco.vn | |
| Website | https://www.vietcalib.vn| https://www.vietnguyenco.vn |
