1. Giới thiệu
Các alkaloid pyrrolizidine (PA) là một nhóm lớn các chất chuyển hóa thứ cấp tự nhiên có cấu trúc alkaloid được tạo ra bởi thực vật để bảo vệ chống lại động vật ăn cỏ. Chúng đã được phát hiện với nồng độ đáng kể trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật, chẳng hạn như dịch truyền thảo dược, trà đen hoặc xanh, rau lá xanh và các sản phẩm từ mật ong.
Trong vòng mười năm qua, ngày càng có nhiều sự chú ý đến sự hiện diện của PA trong thực phẩm, vì nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng gây độc cho gan cũng như khả năng gây ung thư và gây ung thư của chúng. Vì những lý do này, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu đã kết luận rằng các Khu bảo vệ thực vật gây ra mối lo ngại nghiêm trọng về sức khỏe và xếp chúng vào số chất trong thực phẩm cần theo dõi cẩn thận. Giới hạn về nồng độ tối đa cho phép của PA trong thực phẩm là có sẵn chưa. Do đó, ngưỡng thường được chấp nhận ngày nay là giữ nồng độ PA trong thực phẩm ở mức thấp nhất có thể đạt được một cách hợp lý. Từ quan điểm phân tích, PA đại diện cho một nhóm hợp chất đặc biệt khó phân tích. Mặc dù có sẵn các quy trình chuẩn bị và phân tích mẫu, việc phát hiện nhóm chất này vẫn còn đòi hỏi nhiều công nghệ đặc biệt khắt khe. PA là tập hợp của một số chất đồng phân không thể phân biệt chỉ bằng phép đo khối phổ vì trọng lượng phân tử, cũng như khối lượng phân mảnh không đặc trưng cho từng hợp chất. Ngay cả với các công nghệ tách LC hiệu suất cực cao hiện đại cũng không thể phân giải hoàn toàn bằng sắc ký một số hợp chất đồng phân đối quang, chẳng
hạn như các chất đồng phân bổ sung của PA.
Trong bài viết này, một phương pháp sáng tạo để phân tích alkaloid pyrrolizidine trong chiết xuất thảo dược được trình bày bằng cách sử dụng LC-MS/MS SCIEX QTRAP 6500+ . Hệ thống được trang bị Thiết bị tách sử dụng phổ khác biệt di động vi sai SelexION+ (Hình 1).
Hình 1. Hệ thống LC-MS/MS SCIEX QTRAP 6500+ và lắp ráp thiết bị SelexION+: Máy phân tích khối lượng phân tử theo độ khác biệt di động (DMS) được lắp đặt giữa bảng ống hở và bảng rèm được sửa đổi. Vòng gia nối mở rộng nguồn cho phép sử dụng các nguồn SCIEX tiêu chuẩn. Máy DMS được lắp đặt dễ dàng khi cần thiết.
Các tính năng chính của Công nghệ SelexION+ để tách các alkaloid pyrrolizidine
• Phân tách di động vi sai bằng Công nghệ SelexION+ có thể phân biệt giữa các loài đồng phân đối quang không thể phân tách bằng sắc ký
• Công nghệ SelexION+ có thể kết hợp với phân tích MRM trên Hệ thống QTRAP 6500+ để có phương pháp định lượng nhanh 27 alkaloid pyrrolizidine trong chiết xuất thảo dược
2. Phương pháp
Chuẩn bị mẫu: Chất chiết xuất từ thì là, hoa cúc và bạc hà đã được chuẩn bị theo mô tả của Viện Đánh giá Rủi ro Liên bang Đức ( the German Federal Institute for Risk Assessment). Tóm lại, các alkaloid pyrrolizidine từ 2g mẫu được chiết xuất hai lần với 20 mL acid sulfuric 0,05M trong bể siêu âm. Sau khi ly tâm, lọc và điều chỉnh độ pH, phần dịch chiết được tinh chế và cô đặc bằng cách chiết pha rắn sử dụng cột C18. Dịch rửa giải được làm khô dưới dòng khí nitơ, và phần cặn được hoàn nguyên trong 1 mL dung dịch metanol 5%. Đối với các thí nghiệm thêm chuẩn, 180 µL dịch chiết trắng được thêm 20 µL dung dịch chuẩn, thu được nồng độ cuối cùng là 0,125-25 ng/mL, tương ứng với 0,25-50 ng PA trên mỗi gam mẫu.
Sắc ký: Các alkaloid pyrrolizidine được phân tách bằng sắc ký trên cột Phenomenex Luna® Omega C18 (100 x 2,1 mm, 1,6 μm), sử dụng Hệ thống AD SCIEX ExionLC™. Pha động lần lượt là amoni formate 5 mM và acid formic 0,1% trong nước (dung dịch rửa giải A) và trong metanol (dung dịch rửa giải B). Nhiệt độ lò được đặt ở 50 ° C. Thể tích tiêm là 5 µL. Áp suất tối đa trong suốt quá trình chạy sắc ký là <580 bar.
Bảng 1.LC gradient used
Phép đo khối phổ: Hệ thống SCIEX QTRAP 6500+ được trang bị Thiết bị tách di động vi sai SelexION+. Phân tích được thực hiện ở cực dương với quá trình ion hóa phun điện. Các thông số MS đã được tối ưu hóa trên một cột bằng cách tiêm một giải pháp tiêu chuẩn ở các cài đặt khác nhau. Các thông số cuối cùng như sau: nhiệt độ nguồn, 600 °C; khí màn, 20 psi (40 psi cho thí nghiệm không có thiết bị SelexION+); GS1, 40 psi; GS2, 60 psi; điện áp phun ion, 4500V; khí CAD, 9 psi; điện thế vào, 10 V. Điện thế tách lớp, năng lượng va chạm và điện thế thoát khỏi tế bào được thiết lập tùy thuộc vào hợp chất. Điện áp phân tách, SV, của Thiết bị SelexION+ được đặt ở 3800V. Isopropanol được truyền liên tục vào dòng khí rèm với tốc độ 249 µL/phút. Tế bào di động ion được làm nóng đến 150 ° C. Khí phân giải được đặt ở mức trung bình. Đối với mỗi chất phân tích, điện áp bù được tối ưu hóa cụ thể, COV, đã được áp dụng. Dữ liệu được thu thập bằng Thuật toán MRM™ đã lên lịch với thời gian quét mục tiêu là 0,6 giây sử dụng cửa sổ phát hiện MRM là 40 giây.
Hình 2. Sắc ký đồ chồng lên nhau của dung dịch chuẩn chứa các alkaloid pyrrolizidine. Lần chạy này được thực hiện ở nồng độ 0,25 ng/mL của chất chuẩn và được đo mà không cần cài đặt Thiết bị SelexION+.
3. Phân tích
3.1. Tách sắc ký lỏng (LC) các alkaloid pyrrolizidine (PAs)
Hình 3: Nguyên lý hoạt động của công nghệ SelexION. Thanh giao thoa DMS sử dụng một dạng sóng RF không đối xứng (điện áp tách, SV) để tách các ion dựa trên khả năng di động khác nhau giữa các trường cao và thấp. Điện áp bù (COV) được sử dụng để hiệu chỉnh quỹ đạo của ion quan tâm, di chuyển qua thanh giao thoa và vào miệng hút trong khi các nhiễu khác bị lệch vào tường của thanh giao thoa.
Cột Phenomenex Luna Omega Polar C18 với chiều dài 10 cm được sử dụng để phân tích các alkaloid pyrrolizidine trong chiết xuất trà thảo dược và cho phép phân tách sắc ký hầu hết các hợp chất ngoại trừ một số loại đồng phân (Hình 2). Việc sử dụng Công nghệ SelexION+ đã được chứng minh đã làm tăng đáng kể tính chọn lọc của phương pháp này. Do đó, việc phân tách đường nền sắc ký của các đồng phân là không cần thiết và do đó, tổng thời gian chạy có thể giảm xuống còn 12 phút.
3.2. Tách sử dụng phổ khác biệt di động (DMS)
Hình 3 cho thấy nguyên tắc phân tách trong thiết bị di động ion. Giao thoa DMS bao gồm hai tấm phẳng song song và xác định vùng di động. Trong khi các ion được hút bởi dòng khí vận chuyển về phía MS, nguồn điện tạo ra hai sóng hình sin có tần số khác nhau trên mỗi điện cực trong số hai điện cực DMS, dẫn đến trường điện áp cao và thấp dao động (điện áp phân tách, SV). Do sự khác biệt giữa hệ số linh động của ion trường cao và thấp, các ion sẽ di chuyển về phía các bức tường trên đường giống như sóng và rời khỏi đường bay trừ khi quỹ đạo của chúng được điều chỉnh bằng điện áp đối trọng, điện thế một chiều được gọi là điện áp bù, COV. Điện áp bù này có tính đặc hiệu cao đối với từng hợp chất và cho phép loại bỏ các nhiễu nền và tách các chất đồng phân.
3.3. Điều chỉnh các thông số Công nghệ SelexION+
Việc điều chỉnh các thông số Công nghệ SelexION+ được thực hiện dễ dàng bằng cách truyền các tiêu chuẩn. Sau đó, điện áp bù có thể được tăng cường trong khi thay đổi cài đặt cho các thông số khác như điện áp tách, khí phân giải hoặc bổ sung dung môi điều chỉnh vào dòng khí rèm. Mục đích là để có được sự phân tách tốt nhất của các đồng phân trong khi vẫn duy trì cường độ tối đa có thể.
Hình 4 cho thấy kết quả điều chỉnh đối với hỗn hợp tiêu chuẩn của chất trung gian, indicine, lycopsamine và echinatine và các loại oxy hóa của chúng. Các chất phân tích này đặc biệt đòi hỏi khắt khe trong phân tích LC-MS, vì chúng khó phân tách bằng sắc ký và hơn nữa, chúng có cùng sự chuyển đổi trong phân tích MS.
Đối với cả hợp chất không bị oxy hóa và bị oxy hóa, pic mở rộng nhẹ được quan sát thấy khi COV tăng mạnh ở điện áp phân tách tăng dần (Hình 4A), cho thấy sự bắt đầu, sự phân tách rất nhẹ của các đồng phân. Trong bước tiếp theo, khí phân giải được điều chỉnh, làm tăng thời gian lưu trú của các ion trong tế bào và do đó làm tăng độ phân giải của quá trình phân tách. Với lưu lượng khí có độ phân giải được đặt ở mức cao, vai được phát hiện trên các tín hiệu cho cả hai nhóm chất phân tích, nhưng bốn đồng phân vẫn còn lâu mới được tách ra (Hình 4B).
Để cải thiện hơn nữa độ phân giải, isopropanol đã được sử dụng làm chất điều chỉnh và được truyền liên tục vào dòng khí màn. Vì bộ điều chỉnh tạo thành các cụm với các ion chất phân tích, nên tính linh động của chất sau trong tế bào có thể được thay đổi đáng kể. Việc tìm ra chiến lược sửa đổi phù hợp có thể dẫn đến sự phân tách tốt hơn. Hình 4D cho thấy các đường dốc COV với các cài đặt SV khác nhau, với khí phân giải được đặt thành trung bình và isopropanol làm chất điều chỉnh. Với điện áp phân tách tăng lên, các đồng phân đối ảnh được tách ra khỏi nhau nhiều hơn.
Trong thử nghiệm cuối cùng, sử dụng chất điều chỉnh isopropanol và SV 3800 V dựa trên các thử nghiệm trước đó, khí phân giải đã thay đổi. Cài đặt trung bình là sự thỏa hiệp tốt nhất giữa việc tách đủ các loài không bị oxy hóa và tổn thất truyền dẫn của một số loài bị oxy hóa (Hình 4D).
Hình 4: Cân chỉnh các thông số công nghệ SelexION+. Hỗn hợp các chuẩn ở nồng độ 100 ng/mL được đưa vào và COV được tăng dần dưới nhiều điều kiện khác nhau. (Bên trái) XICs chồng lên nhau của intermedine, indicine, echinatine và lycopsamine. (Bên phải) XICs chồng lên nhau của intermedine-N-oxide, indicine-N-oxide, echinatine-N-oxide và lycopsamine-N-oxide. (A) Không sử dụng chất điều chỉnh, khí phân giải được đặt ở chế độ mở (không áp dụng khí), COV tăng dần ở các giá trị SV khác nhau. (B) Không sử dụng chất điều chỉnh, SV được đặt ở 3800 V, COV tăng dần ở các cài đặt khí phân giải khác nhau. (C) Sử dụng isopropanol làm chất điều chỉnh, khí phân giải được đặt ở mức trung bình, COV tăng dần ở các giá trị SV khác nhau. (D) Sử dụng isopropanol làm chất điều chỉnh, SV được đặt ở 3800 V, COV tăng dần ở các cài đặt khí phân giải khác nhau.
3.4. Thêm tính chọn lọc với sự phân tách di động vi sai
Mặc dù indicine, lycopsamine và echinatine, cũng như indicineN oxit và intermedine-N-oxide, không thể phân tách bằng sắc ký (Hình 5A), nhưng chúng có thể được phân giải dễ dàng khi sử dụng Công nghệ SelexION+ (Hình 5B). Điện áp bù dành riêng cho hợp chất, được xác định trong quá trình điều chỉnh Thiết bị SelexION, đóng vai trò là thông số hiệu quả để tăng tính chọn lọc.
Hình 5: Công nghệ SelexION để phân biệt các enantiomer alkaloid pyrrolizidine không có sự phân chia sắc ký. (A) MRM không sử dụng DMS (hỗn hợp chuẩn được tiêm). (B) MRM sử dụng DMS (hỗn hợp chuẩn được tiêm). Im – Intermedine; In – Indicine; La – Lycopsamine; Ech – Echinatine; Im(N) – Intermedine (-N-oxide); In(N) – Indicine (-N-oxide); La(N) – Lycopsamine (-N-oxide); Ech(N) – Echinatine-N-oxide.
Tiếp theo, tính chọn lọc của việc sử dụng DMS với Q1 Multiple Ion được so sánh với phương pháp MRM tiêu chuẩn của ngành (Hình 6) sử dụng chiết xuất bạc hà cay. DMS cung cấp sự gia tăng tính chọn lọc của quét Q1 MI so với quét Q1 MI không có DMS và tính chọn lọc tương tự như thử nghiệm MRM cổ điển. Vì lý do này, việc theo dõi một quá trình chuyển đổi MRM duy nhất cho từng hợp chất PA khi làm việc với thiết bị di động ion được coi là đủ, cho phép tăng thời gian dừng và do đó cải thiện nhiễu tín hiệu ở nồng độ thấp hơn.
Hình 6. So sánh tính chọn lọc của các chế độ quét với DMS. Hiển thị một chiết xuất bạc hà được tăng cường với một hỗn hợp alkaloid pyrrolizidine. (A) Quét nhiều ion Q1 cổ điển. (B) Quét nhiều ion Q1 với DMS được bật. (C) Quét MRM. Tính chọn lọc của quét nhiều ion Q1 sử dụng DMS tiệm cận với tính chọn lọc của quét MRM.
Hình 7 chứng minh rằng Thiết bị SelexION không chỉ tách các hợp chất đồng phân mà còn loại bỏ các chất gây nhiễu nền. Như được thể hiện trong Hình.7A, một hợp chất nền đã có trong dịch chiết mẫu trắng bạc hà rửa giải rất gần với heliotrine-N-oxit, cản trở quá trình định lượng đúng và chính xác ở nồng độ thấp. Tuy nhiên, với Công nghệ SelexION+, hiện tượng nhiễu được loại bỏ, tạo ra một mẫu trắng sạch hơn sao cho có thể dễ dàng tích hợp tín hiệu của heliotrine-N-oxide. Một ví dụ khác, dấu vết lasiocarpine-N-oxide cho thấy mức độ nhiễu xung quanh cao, trong khi nhiễu được loại bỏ hoàn toàn bằng Công nghệ SelexION (Hình 7B).
Hình 7. Tín hiệu nhiễu có thể được loại bỏ bằng DMS. So sánh mẫu trống chiết xuất bạc hà (Trái) với mẫu chiết xuất được tăng cường ở nồng độ 0,125 ng/mL (0,25 ppm trong nguyên liệu thô, Phải). (A) XICs của heliotrine-N-oxide với DMS tắt và bật làm nổi bật việc loại bỏ một đỉnh nền cụ thể bằng cách sử dụng DMS. (B) XICs của lasiocarpine-N-oxide lại với DMS tắt và bật cho thấy sự giảm thiểu đáng kể của một nền cao.
Tất cả các hợp chất hoạt động tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,25-25 ng/mL với hệ số tương quan lớn hơn 0,99. Nồng độ cao hơn chưa được thử nghiệm, nhưng có thể mong đợi rằng phạm vi nồng độ có thể được mở rộng do phạm vi động tuyệt vời của hệ thống SCIEX QTRAP 6500+ LCMS/MS
3.5. Định lượng alkaloid pyrrolizidine trong các mẫu thự vật thực tế.
Các mẫu bạc hà, hoa cúc, cần tây, hương thảo, hoa ké đầu ngựa và trà đỏ khác nhau đã được phân tích bằng phương pháp mục tiêu đã phát triển. Bảng 2 tóm tắt các mức độ phát hiện của các loại PAs khác nhau trong các mẫu. Kết quả nhấn mạnh nhu cầu của một phương pháp phân tích có tính chọn lọc và nhạy cảm, vì các mẫu khác nhau chứa các loài enantiomer ở nồng độ khác nhau. Chỉ có tính chọn lọc của di động ion và do đó là xác định cấu trúc chính xác của PAs cho phép đánh giá độc tính chính xác của các mẫu. Công nghệ SelexION+ là công nghệ mạnh mẽ để tăng đáng kể tính chọn lọc của một thí nghiệm MRM. Nó đặc biệt hữu ích trong việc loại bỏ nhiễu gây trở ngại cho việc phát hiện nhạy cảm hoặc tích hợp chính xác của các chất phân tích và. Và phân biệt giữa các hợp chất đồng phân không thể tách bằng sắc ký hoặc phổ khối lượng một mình. Phương pháp được trình bày cho thấy sự định lượng khác biệt của 27 alkaloid pyrrolizidine, có liên quan đến phân tích chiết xuất thảo dược và trà. Việc xác định rõ ràng các cấu trúc khác nhau này có thể giúp đánh giá chính xác hơn tính liên quan về độc tính của sự hiện diện của PAs trong thực phẩm.
Bảng 2. Hàm lượng của alkaloid pyrrolizidine trong các loại thảo mộc. Các mức độ của alkaloid pyrrolizidine trong bạc hà, hoa cúc và cần tây đã được tính toán bằng phương pháp hiệu chuẩn với chất chuẩn tương ứng. Đối với hương thảo/hoa ké đầu ngựa và trà đỏ, đường cong hiệu chuẩn từ cần tây và dung môi tinh khiết đã được sử dụng, tương ứng. Các nồng độ được biểu thị bằng ng PA/g nguyên liệu thô.
Tài liệu tham khảo:
1. Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA CONTAM Panel (EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain), EFSA Journal (2017) 15(7): 4908.
2. Aktualisierte Risikobewertung zu Gehalten an 1,2- ungesättigten Pyrrolizidinalkaloiden (PA) in Lebensmitteln.
Stellungnahme Nr. 020/2018 des BfR vom 14. Juni 2018.
3. Bestimmung von PA in Pflanzenmaterial mittels SPE-LCMS/MS, Bundesinstitut für Risikobewertung, BfR-PA-Tee-2.0/2014.
4. Vorläufige Empfehlungen des BfR zur Analytik von Pyrrolizidinalkaloiden (PA) in Kräutertee und Tee (Analysespektrum und Probenahme-verfahren), Mittteilung Nr. 002/2016, BfR, 5. January 2016.
5. Dzuman et al. (2020) Development of a new LC-MS method for accurate and sensitive determination of 33 pyrrolizidine and 21 tropane alkaloids in plant-based food matrices. Anal. Bioanal. Chem. 412, 7155.
6. SelexION® Technology: The solution to selectivity challenges in quantitative analysis, SCIEX technical note
RUO-MKT-02-3251-A
| CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI – DỊCH VỤ – KỸ THUẬT VIỆT NGUYỄN | |
| Địa chỉ | VPHCM: số N36, đường số 11, P. Tân Thới Nhất, Q.12, Tp. Hồ Chí Minh
VPĐN: Số 10 Lỗ Giáng 5, phường Hòa Xuân, quận Cẩm Lệ, Tp. Đà Nẵng VPHN: Tầng 1, toà nhà INTRACOM, 33 Cầu Diễn, P. Phúc Diễn, Q. Bắc Từ Liêm, Tp.Hà Nội VP Cần Thơ: 275 Xuân Thủy, P. An Bình, Q. Ninh Kiều, Tp. Cần Thơ |
| Hotline | PHÒNG MARKETING – TRUYỀN THÔNG:
|
| info@vietnguyenco.vn | |
| Website | https://www.vietcalib.vn| https://www.vietnguyenco.vn |
