Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LCMS?

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LCMS?

• Máy sắc ký lỏng khối phổ LCMS là phương pháp được dùng trong phân tích vết (ppb, ppm) các hợp chất cần nhận danh chính xác. Trong những điều kiện vận hành nhất định ngoài thời gian lưu đặc trưng, các chất còn được nhận danh bằng khối phổ (tỷ số khối lượng (m)/ điện tích (z)) của nó.
• Công ty YL Instruments Co., Ltd bao gồm: máy sắc ký khí (GC); máy sắc ký khí khối phổ (GCMS); sắc ký lỏng cao áp (HPLC); sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (LCMS) và phần mềm hệ thống sắc ký. Công ty YL Instruments Co., Ltd còn sản xuất máy lọc nước siêu sạch (WPS) cũng như máy quang phổ hồng ngoại Fourier (FTIR).Các model sản phẩm Công ty YL Instruments Co., Ltd:
  1. Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC/ Compact/ UHPLC/ HPC/ GEL: YL9100 Plus | YL9300  | ChroZen UHPLC | YL9100S | YL9100S | YL9100 GPC
  2. Sắc ký lỏng khối phổ 01 tứ cực LCMS: Model: YL9900 LC/MS + YL9100 Plus
  3. Máy sắc khí GC đầu dò thường: YL6500 GC
  4. Sắc ký khí khối phổ GCMS: YL6900 GC/MS
  5. Máy lọc nước siêu sạch loại I phòng thí nghiệm: aquaMAX™ Ultra Series
  6. Máy lọc nước loại II, loại III phòng thí nghiệm: aquaMAX™ Basic Series
  7. Máy sinh khí Nitrogen Nitrogen Generators: MISTRAL EVOLUTION | N2 Tower Plus | Model: N2-Whisper
  8. Máy sinh khí Hydro Hydrogen Generator: NM H2 Plus Series | PG H2 Plus Series
  9. Máy sinh Khí Zero ( Zero air generator): GT Series | GT Series
  10. Máy sinh khí Hydrogen/Air Generator: FID Tower Plus | Whisper Hybrid
  11. Máy quang phổ hồng ngoại FTIR Spectrometer: YL2000 | YL2300

1.   Nguyên lý chung phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LCMS:

• Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
• Trong nghiên cứu khối phổ m/z của bất kỳ chất/ hợp chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dương (+) thường cho nhiều thông tin hơn về ion âm (-) nên được dùng phổ biến hơn. Hiện nay, các thiết bị có chức năng  tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thường độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng lẻ.
• Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LCMS phải đảm bảo được sự tương thích giữa hệ thống sắc ký lỏng HPLC và đầu dò khối phổ MS. Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng.
  Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện (interface technology); hiện lại máy sắc ký lỏng khối phổ LCMS dùng kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API).Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API) API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
  Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API) API trong LC/MS:
  • Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).
  • Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization – APCI).
  • Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization – APPI).

  Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả.

2. Các loại đầu dò sắc ký lỏng khối phổ LCMS:

• Hiện nay, có bốn kiểu đầu dò sắc ký lỏng khối phổ LCMS chính đang được sử dụng bao gồm:
  • Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT)
  • Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS).
  • Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF)
  • Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole)
• Chúng rất khác nhau về thiết kế và thao tác, với những ưu và nhược điểm riêng.

(1) Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT):

• Đối với loại đầu dò khối phổ bẫy ion, các ion trước hết được bắt hoặc “mắc bẫy” trong một khoảng thời gian nhất định rồi được phân tích bằng MS hoặc MS/MS. Loại máy này được sử dụng khá rộng rãi (xét theo những công bố khoa học). Tuy nhiên, chúng có độ chính xác không cao do chỉ có một số lượng khá hạn chế các ion có thể tích lũy vào tâm điểm trước khi được tích điện trong không gian, do vậy có thể phản ánh sai lệch sự phân bố và phép đo. Người ta cũng đã tiến hành cải tiến kỹ thuật trên bằng sự phát triển các bẫy ion “tuyến tính” hoặc “hai chiều” khi những ion được tập hợp trong một thể tích hình ống lớn hơn bẫy ion ba chiều truyền thống, cho phép làm tăng độ nhạy, độ phân giải và độ chính xác.

(2) Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (S):

• Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier FT-MS bản chất cũng là một loại khối phổ bẫy ion, cho phép bắt những ion dưới độ chân không sâu trong một từ trường cao. Do được cải tiến và kết hợp cả hai loại máy nên FT-MS có độ nhạy, độ chính xác và phân giải cao. Tuy nhiên, do vận hành phức tạp và giá thành quá cao nên chúng ít được sử dụng trong phân tích dư lượng.

(3) Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF):

• Đối với đầu dò khối phổ thời gian bay, tất cả các ion đơn điện tích nào chịu một sai biệt về thế năng V sẽ đạt một năng lượng chuyển hóa eV (electron volt) như nhau. Vì vậy, những ion có khối lượng lớn hơn sẽ có vận tốc nhỏ hơn nên mất nhiều thời gian hơn để bay qua cùng một quãng đường dài trong một ống không có từ trường (field-free flight tube). Các ion, sau khi được tăng tốc, bay ngang qua vùng không trường, nơi đây chúng sẽ được tách riêng nhau ra tùy theo giá trị m/z của chúng, và được tập trung tại bộ phận thu nhận tín hiệu. Do thời gian đến đích của các ion chỉ cách nhau rất ngắn, 10-7 giây, nên máy cần có hệ thống điện tử cực nhạy để có thể phân biệt được các ion.

(4) Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole):

• Đầu dò tứ cực (một hoặc ba tứ cực) có độ nhạy cao trong phân tích định lượng một chất đã biết, tạo được nhiều phân mảnh trong chế độ MS/MS, có thể làm được kiểu đo mất phân tử trung hòa (neutral loss), thích hợp cho phân tích vi lượng các chất đã biết trước cấu trúc. Tuy nhiên, đầu dò tứ cực khó giải thích cơ chế phân mảnh MS/MS.

3. Nguồn ion hóa trong đầu dò khôi phổ LCMS:

(1) Ion hóa tia điện (ESI):

• Ion hóa tia điện (ESI):ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kỹ thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như polyethylen glycol.
• Trong ESI, các ion được hình thành như sau:

            Hình 9: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI

• Được bắt nguồn từ hệ thống sắc ký lỏng, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích điện tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối.
• Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch. Các dung môi phù hợp để phun sương là: methanol, acetonitrile, ethanol,…

(2) Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI):

• APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi.
• Trong APCI, ion đươc hình thành như sau: mẫu hợp chất cần phân tích, hòa tan trong pha động, sau khi ra khỏi cột sắc ký, được cho đi ngang qua ống mao quản đốt nóng. Khi ra khỏi ống, nhờ khí N¬2, dung dịch được phun thành dạng sương từ đầu ra của nguồn APCI. Các giọt sương nhỏ được một dòng khí dẫn đến một ống thạch anh đun nóng, gọi là buồng dung môi hóa khí. Hợp chất đi theo luồng khí nóng ra khỏi ống để đến một vùng có áp suất khí quyển, nơi đây sẽ xảy ra sự ion hóa hóa học nhờ vào que phóng điện corona, tại đây có sự trao đổi proton để biến thành ion dương (M + H)+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thành ion âm (M – H)-. Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bộ phân tích khối.
• Lựa chọn kiểu tạo ion

(3) Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI):

• Thông thường, hợp chất phân tích thường ion hóa bằng nguồn ESI hoặc APCI, tuy nhiên, có một số chất không được ion hóa tốt bằng hai kỹ thuật này, ví dụ như polyaromatic hydrocarbons (PAHs), người ta sẽ sử dụng nguồn APPI. Kết hợp ưu điểm của giữa dòng khí phun thẳng góc với dòng ion, đèn krypton trong nguồn sẽ phát ra các photon có năng lượng cao đủ để ion hóa nhiều hợp chất hóa học khác nhau.

*** Ngoài ba nguồn ion hóa trên, còn có nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Multimode ionization) có thể vận hành, thao tác ở hai chế độ ion hóa ESI và APCI.

4. Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ LCMS:
(1) Scan:

• Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.

(2) Selected Ion Monitoring (SIM): 

• Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.

(3) SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring):

• Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
• SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
• MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.

Mọi thông tin xin liên hệ:

CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI DỊCH VỤ KỸ THUẬT VIỆT NGUYỄN

Địa chỉ: 211/10/1 Vĩnh Viễn – P.04 – Q.10 – Tp. Hồ Chí Minh

Tel: 028.66 570 570                | Fax: 028.62 55 77 09

Hotline: 0932 664422

Mail: info@vietnguyenco.vn | Web: www.vietnguyenco.vn