Tối ưu hóa hiệu năng với aeMRM trên hệ thống SCIEX novus V55

Andrew Folkerson¹, Holly Lee¹, David Cox¹, Michael Deng¹, Craig Butt², Dan Biggerstaff³, HuiChen Stavros³, Kelly Cheshire³, JoeLackey³

Tài liệu kỹ thuật mô tả định lượng hơn 500 chất thuốc bảo vệ thực vật trong nước ép cam với một lần tiêm kết hợp phương pháp chuyển cực sử dụng công nghệ Accelerated MRM [aeMRM] trên hệ thống novus V55. Nhờ tốc độ chu kỳ quét nhanh có thể thu thập hơn 1,400 chuyển tiếp MRM ở cả chế độ âm và dương, giúp mở rộng đáng kể phạm vi các chất phân tích trong các phương pháp phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật.

Điểm nổi bật của aeMRM trong phân tích thực phẩm:

• Tối đa hóa phạm vi phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: chu kỳ quét MRM với tốc độ chuyển cực nhanh cho phép theo dõi một số lượng lớn hợp chất trong cùng một lần tiêm mà vẫn duy trì được chất lượng dữ liệu thu nhận.
• Tăng tốc quá trình phân tích mẫu: Thu thập dữ liệu nhanh hơn, peak hẹp hơn, gradient ngắn hơn và cửa sổ thời gian lưu linh hoạt hơn, giảm tổng thời gian phân tích và nhu cầu tiêm lại do thay đổi RT
• Cải thiện khả năng nhận danh hợp chất: bao gồm nhiều chuyển tiếp MRM tăng cường khả năng nhận danh trong nền mẫu thực phẩm

Hình 1: Định lượng MRM tốc độ cao với aeMRM trên novus V55. Hình bên trái so sánh sắc ký đồ có hơn 1400 chuyển tiếp MRM trong nước cam sử dụng gradient 30 phút (trên) và 20 phút (dưới). Gradient 20 phút sử dụng aeMRM cho thấy cường độ và mật độ dữ liệu tương tự trên mỗi peak (≥10) như gradient 30 phút, ngay cả trong các giai đoạn đồng thời MRM cao nhất (369 chuyển tiếp, 20 phút; 247 chuyển tiếp, 30 phút). Cả hai gradient đều cho thấy giới hạn định lượng (LOQ) trong mẫu tương tự, với hầu hết đều dưới giới hạn dư lượng tối đa (MRL) điển hình là 10 µg/kg (đường chấm đỏ) được quy định cho hầu hết các loại thuốc bảo vệ thực vật..

Giới thiệu

Việc phân tích đồng thời nhiều thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm luôn đối mặt với hai thách thức lớn là sự đa dạng của các chất phân tích và độ phức tạp của nền mẫu. Các phương pháp thường bao gồm từ hàng trăm đến hàng nghìn hợp chất cần phân tích, điều này có thể ảnh hưởng đến chất lượng dữ liệu, đặc biệt tại các vùng có mức độ đồng thời MRM cao. Trong các vùng này, số điểm dữ liệu trên peak sắc ký rất quan trọng để định lượng chính sắc. Kéo dài chương trình gradient sắc ký để cải thiện khả năng tách và làm giảm độ đồng thời của các chuyển tiếp MRM, nhưng cũng làm giảm năng suất phân tích mẫu.

Hệ thống SCIEX novus V55 System được trang bị bộ dẫn ion Q0 (Q0 ion guide) tích hợp các điện cực gia tốc, được thiết kế nhằm tăng tốc quá trình truyền ion qua hệ thống (Hình 2). Kết hợp giữa công nghệ điện cực gia tốc Q0 và các thuật toán điều khiển mới trong phần mềm, một chế độ MRM mới được gọi là MRM gia tốc (aeMRM) mang lại tốc độ lên đến 1000 MRM mỗi giây. Hình 2 thể hiện chu kỳ quét dưới dạng một cấu trúc bậc thang gồm các đoạn pause time, được phân tách bởi các đoạn dwell time thẳng đứng, với mỗi bước tương ứng với một chuyển đổi MRM. Tổng thời gian chu kỳ bằng số lần chuyển tiếp MRM nhân với tổng pause time và dwell time được gán cho mỗi lần chuyển tiếp. Hình 2 mô tả chu kỳ quét nhanh hơn cho phép tăng đồng thời năng suất phân tích, đồng thời duy trì hiệu suất định lượng với mật độ điểm dữ liệu cao hơn trên các đỉnh sắc ký.

Hình 2: Lợi ích của chu kỳ quét MRM nhanh hơn khi sử dụng aeMRM trên hệ thống novus V55

Trong nghiên cứu này, phương pháp aeMRM được phát triển để định lượng đồng thời hơn 500 dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong nước cam. Bằng cách kết hợp khả năng phân tích đồng thời nhiều hợp chất, gradient sắc ký ngắn hơn và cửa sổ RT linh hoạt hơn được chứng minh trong cả dung môi và mẫu thêm chuẩn.

Phương pháp

Chuẩn và mẫu:

Dung dịch chuẩn methanol/nước 50:50 (v/v) và trong chiết xuất nước cam. Không sử dụng chất chuẩn nội (IS).

Chuẩn bị mẫu:

Lấy 1 mL nước cam pha loãng với 9 mL hỗn hợp methanol/nước 50:50 (v/v), sau đó lọc qua màng lọc syringe 0,45 µm trước khi thêm chất chuẩn. Nồng độ chất chuẩn sau khi thêm từ 0,01 ng/mL đến 50 ng/mL trong lọ, tương đương với 0,1 – 500 ng/mL trong mẫu sau khi pha loãng 10 lần trong quá trình chuẩn bị mẫu.

Sắc ký:

Sử dụng cột Phenomenex Luna Omega C18 100 x 2,1 mm, 1,6 µm. Tốc độ dòng là 0,3 mL/min, thể tích tiêm là 2 µL và nhiệt độ cột là 50°C.

Khối phổ:

Phân tích được thực hiện bằng phương pháp ESI với chuyển đổi cực trên hệ thống novus V55. Dữ liệu được thu thận bằng phương pháp giám sát phản ứng đa điểm theo lịch trình (sMRM) với các điều kiện nguồn và khí được tối ưu hóa (Bảng 3) và các thông số phụ thuộc vào hợp chất, với ít nhất 2 chuyển tiếp cho mỗi chất phân tích. Đối với phương pháp 30 phút, pause time và dwell time lần lượt là 3 ms và 2 ms, trong khi pause time và dwell time là 2 ms và 1 ms được sử dụng cho phương pháp 20 phút.

Phần mềm: SCIEX OS 5.0

Xác định thời gian lưu (RT) cho bộ chỉ tiêu lớn trong một lần tiêm

Phương pháp phát triển thường bắt đầu bằng việc thu thập MRM không theo lịch trình để xác định thời gian lưu giữ (RT) của các chất phân tích, nhưng điều này có thể tốn thời gian và mẫu đối với số lượng lớn, thường yêu cầu nhiều lần tiêm để duy trì MRM đồng thời hợp lý. Pause time và dwell time thường nằm trong phạm vi vài mili giây, nhưng điều này phụ thuộc vào độ rộng đỉnh sắc ký, số lượng MRM và tốc độ thiết bị. Ví dụ, pause time và dwell time lần lượt là 3–5 ms và 3 ms đã được sử dụng trước đây cho 1860 chuyển tiếp trên hệ thống SCIEX 5500+.

Hình 3 minh họa cách aeMRM cho phép pause time 0,7 ms và dwell time 1 ms, tạo ra chu kỳ quét tổng cộng là 1,7 ms. Kết hợp với thời gian chuyển đổi cực nhanh 5 ms, một phương pháp MRM không theo lịch trình đã được phát triển để xác định thời gian lưu (RT) của toàn bộ   bảng 1411 chuyển tiếp MRM, bao gồm cả các chuyển tiếp MRM định lượng và định tính cho mỗi trong số hơn 700 loại thuốc bảo vệ thực vật trong hỗn hợp chuẩn. Mặc dù tốc độ chu kỳ cao hơn được sử dụng ở đây không được khuyến nghị cho định lượng, nhưng nó cho phép mật độ điểm dữ liệu đủ để xác nhận RT. Việc theo dõi nhiều chuyển tiếp MRM cũng giúp xác nhận RT của các hợp chất thể hiện nhiều peak, chẳng hạn như methabenzthiazuron và ametryn (Hình 3), giảm nhu cầu tiêm lại. Nhìn chung, aeMRM cho phép phát hiện RT của tất cả các chất phân tích ở cả hai cực trong một lần tiêm duy nhất, giúp đẩy nhanh đáng kể quá trình phát triển phương pháp và tiết kiệm các tiêu chuẩn phân tích.

Tính linh hoạt cao hơn trong cửa sổ RT

Khi nhu cầu về số lượng chất phân tích tăng lên trong kiểm nghiệm thực phẩm, sự phụ thuộc vào tốc độ của các thiết bị khối phổ ba tứ cực để duy trì chất lượng dữ liệu cũng tăng lên. MRM theo lịch trình (sMRM) được coi là phương pháp tiêu chuẩn vàng cho định lượng mục tiêu, đặc biệt là đối với các bảng lớn, nơi mà sự đồng thời của MRM có thể được kiểm soát thông qua các cửa sổ RT.

Hình 3. Tận dụng aeMRM để phát hiện RT nhanh chóng chỉ trong một lần tiêm trong quá trình phát triển phương pháp.

Hình 4. Lợi ích của aeMRM trong việc mở rộng cửa sổ RT để giảm thiểu sự dịch chuyển RT

Các cửa sổ RT hẹp hơn (≤30 giây) thường được sử dụng để bù đắp cho mật độ điểm dữ liệu kém trong các phương pháp có độ đồng thời MRM cao, nhưng điều này làm tăng nguy cơ cắt cụt đỉnh hoặc thậm chí mất dữ liệu nếu RT thay đổi do lão hóa cột, hiệu ứng nền mẫu và dao động của thiết bị. Chu kỳ quét nhanh hơn cung cấp mật độ điểm dữ liệu bổ sung, cho phép thu được đầy đủ các đỉnh sắc ký và mở rộng cửa sổ RT một cách an toàn mà không làm giảm chất lượng đỉnh. Hình 4 minh họa cách aeMRM cho phép sử dụng cửa sổ RT 80 giây để thu được đầy đủ các đỉnh của thiabendazole và propamocarb mặc dù có sự dịch chuyển nhỏ so với RT ban đầu của chúng. Bất kỳ sự dịch chuyển nào nữa, thường gặp trong các nền mẫu thực phẩm phức tạp theo thời gian, có thể dẫn đến cắt cụt đỉnh hoặc thậm chí mất hoàn toàn đỉnh nếu sử dụng cửa sổ hẹp hơn (Hình 4). Nhìn chung, aeMRM cho phép sử dụng cửa sổ RT rộng hơn trong phương pháp, giúp tốt hơn các biến thể thực tế về tuổi thọ cột, nền mẫu, sự khác biệt giữa các lô và sự dao động của thiết bị.

Ngoài ra, mật độ điểm dữ liệu cao hơn do aeMRM cung cấp tạo ra các đỉnh sắc ký rõ nét hơn, cải thiện khả năng tái lập và đơn giản hóa việc xem xét peak.

Tăng tốc độ phân tích mẫu với thời gian sắc ký ngắn hơn trong khi vẫn duy trì chất lượng dữ liệu

Do sự đa dạng về tính chất lý hóa trong hỗn hợp thuốc bảo vệ thực vật, các điều kiện nguồn đã được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu suất độ nhạy tốt cho phần lớn các chất phân tích.

Phương pháp cuối cùng đã theo dõi 1411 chuyển tiếp (1260 dương, 151 âm) cho 533 loại thuốc bảo vệ thực vật. Một tập hợp con gồm 100 loại thuốc bảo vệ thực vật đã được chọn để phân tích chi tiết hơn về các đặc tính hiệu suất định lượng, bao gồm độ nhạy, ảnh hưởng của nền mẫu, tỷ lệ ion, LOQ, độ chính xác và độ lặp lại (%CV), so sánh với các tiêu chí được chấp nhận trong SANTE 11312/2021 v2.2. Việc lựa chọn được thiết kế để đại diện cho toàn bộ nhóm chất phân tích dựa trên hiệu suất tín hiệu trên nhiễu (S/N) khác nhau và phạm vi m/z, RT phân bố trên toàn bộ sắc ký đồ và cả hai chế độ.

Việc rút ngắn gradient và chuyển đổi cực đang ngày càng được áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm thực phẩm, chủ yếu do nhu cầu về năng suất phân tích mẫu và chất phân tích cao hơn. Cả hai cách này đều làm tăng khả năng xử lý đồng thời MRM, đặc biệt là trong các phương pháp phân tích hàng trăm đến hàng nghìn chất phân tích, làm tăng thêm sự đánh đổi giữa chất lượng dữ liệu và năng suất phân tích. Tuy nhiên, việc thu nhận MRM nhanh hỗ trợ các peak sắc ký hẹp hơn và gradient nhanh hơn, cho phép thời gian chạy ngắn hơn và cuối cùng, làm năng suất phân tích mẫu.

Bằng cách tận dụng aeMRM, sự kết hợp giữa pause time (2 ms) và dwell time (1 ms) cho phép khả năng xử lý đồng thời MRM cao hơn. Do đó, phương pháp 20 phút nhanh hơn mà không làm giảm chất lượng dữ liệu so với phương pháp 30 phút sử dụng pause time 3 ms và dwell time 2 ms. Mặc dù quá trình sắc ký được giảm xuống còn gradient 20 phút, aeMRM giúp duy trì được cường độ tín hiệu và mật độ điểm dữ liệu trên mỗi peak LC (≥10), ngay cả trong vùng có độ đồng thời MRM cao nhất (369 chuyển tiếp) (Hình 1).

Hình 5. Biểu đồ phân bố tần suất của tỷ lệ peak tương đối giữa phương pháp 20 phút (aeMRM) và 30 phút (MRM) trên đường chuẩn trên mẫu (0,01–50 ng/mL).

Hình 5 cũng cho thấy hiệu suất độ nhạy tương tự giữa 2 gradient, trong đó 88% tập hợp con được xử lý trong phương pháp 20 phút giữ lại ≥85% diện tích peak phản hồi so với phương pháp 30 phút.

Hình 6. So sánh sự khác biệt về tỷ lệ ion giữa các mẫu thêm chuẩn và chuẩn trong dung môi trong phương pháp 30 phút (màu xanh lam) và 20 phút (màu xanh lục).

Giới hạn định lượng (LOQ) cũng tương đương giữa 2 gradient, nằm trong khoảng từ 0,1 đến 50 µg/kg, với hầu hết nằm dưới mức dư lượng tối đa toàn cầu (MRL) là 10 µg/kg trong nước cam (Hình 1). Việc lựa chọn LOQ dựa trên độ chính xác (±20%), độ chính xác (%CV <20%), S/N ≥10 và tỷ lệ ion (±30%). Tỷ lệ ion, được biểu thị bằng thương số diện tích peak của chuyển tiếp định tính so với chuyển tiếp định lượng, được sử dụng để nhận danh bằng cách so sánh các giá trị được tính toán trong chất phân tích mẫu chiết và các chất chuẩn trong dung môi thu được trong cùng điều kiện. Tỷ lệ ion của mẫu được so sánh với các tỷ lệ của chất chuẩn trong dung môi. Cả hai phương pháp 30 phút và 20 phút đều cho thấy sự khác biệt về tỷ lệ ion trong phạm vi dung sai ±30% để nhận danh, được nêu trong SANTE 11312/2021 v2 (Hình 6). Khả năng lặp lại được đánh giá dựa trên độ chính xác diện tích peak (%CV) được đo từ ba lần tiêm mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau. Đối với cả hai phương pháp 30 phút và 20 phút, phần lớn tập hợp con được xử lý cho thấy %CV nhỏ hơn ngưỡng độ chính xác 20% được nêu trong SANTE 11312/2021 v2, với khả năng tái lập được cải thiện ở nồng độ cao hơn (Hình 7).

Hình 7. So sánh diện tích peak %CV được tính toán từ ba lần tiêm (n = 3) mẫu chuẩn thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau giữa phương pháp 30 phút (màu xanh lam) và 20 phút (màu xanh lục).

Nhìn chung, độ nhạy, mật độ điểm dữ liệu, LOQ, tỷ lệ ion, độ chính xác phần lớn được duy trì giữa phương pháp 20 phút và 30 phút, dẫn đến tiết kiệm khoảng 30% thời gian cho mỗi mẫu. Điều này giúp giảm bớt những lo ngại về sự đánh đổi giữa độ nhạy và tốc độ thu nhận dữ liệu đã được chứng minh trước đó trong một thử nghiệm trên diện rộng bao gồm 931 độc tố nấm mốc và các chất chuyển hóa thứ cấp khác. Trong nghiên cứu đó, việc phát triển phương pháp từ thử nghiệm HPLC-MS/MS tiêm kép sang UPLC-MS/MS chuyển đổi cực tiêm đơn đã giảm thời gian chạy xuống còn một nửa, nhưng phải trả giá bằng việc tăng LOQ do các vấn đề về độ lặp lại. Ở đây, việc thu nhận dữ liệu aeMRM nhanh trên hệ thống novus V55 cung cấp một phương pháp có thể mở rộng để giải quyết các bảng phân tích ngày càng tăng và nhu cầu năng suất cao hơn, đồng thời duy trì hiệu suất định lượng.

Kết luận

• Bằng cách tận dụng khả năng thu nhận dữ liệu aeMRM trên hệ thống novus V55, chu kỳ MRM nhanh chóng đã tăng số lượng chuyển tiếp MRM trong khi vẫn duy trì hiệu suất định lượng mạnh mẽ, cho phép mở rộng bảng phân tích, các chuyển tiếp MRM xác nhận bổ sung để cải thiện độ tin cậy nhận danh, peak có thể tái lập hơn và xem xét peak nhanh hơn, khả năng chịu đựng tốt hơn đối với sự thay đổi RT và thời gian chạy ngắn hơn để tăng công suất phân tích mẫu.
• Chu kỳ quét (ms) trên aeMRM đã giúp chuyển đổi quy trình làm việc đa tiêm trước đây thành phương pháp tiêm đơn, bù đắp sự đánh đổi giữa độ nhạy và tốc độ thu nhận dữ liệu gặp phải trong chế độ MRM thông thường.
• Hệ thống novus V55 cho phép các phòng thí nghiệm thực phẩm mở rộng công suất một cách hiệu quả, tối đa hóa không gian phòng thí nghiệm hạn chế đồng thời hỗ trợ các hoạt động tiết kiệm năng lượng và tài nguyên cũng như tăng công suất phân tích mẫu tạo doanh thu.

Xem chi tiết nghiên cứu tại: Maximizing throughput with accelerated MRM (aeMRM) on the novus V55 system

Việt Nguyễn là đại lý phân phối chính thức các sản phẩm của SCIEX tại Việt Nam.

Quý khách hàng cần hỗ trợ tư vấn, xin liên hệ Việt Nguyễn thông tin sau: